衰老会改变骨骼肌中由半胱氨酸氧化调节的氧化还原信号通路：基于整合组学技术和人工智能的结构预测研究

《Experimental Physiology》：Ageing alters cysteine oxidation-regulated redox signalling in skeletal muscle: Integrative omics and AI-based structural predictions

　　

老龄化与骨骼肌质量和力量丧失（肌少症，sarcopenia）及氧化还原稳态（redox homeostasis）破坏相关。氧化还原信号（redox signalling）对肌肉适应至关重要，但老龄化如何破坏基于半胱氨酸（cysteine）的调节机制尚不明确。老龄肌肉中位点特异性反应性和信号特异性的驱动因素仍然未知。本研究查询了OxiMouse数据集（OxiMouse dataset）以绘制骨骼肌中与年龄相关的半胱氨酸氧化图谱，并利用人工智能（AI）模拟关键半胱氨酸残基上的氧化修饰，以预测特定蛋白质的结构和功能后果。研究发现，老龄化通过选择性氧化离散的半胱氨酸残基，以位点特异性方式重塑氧化还原景观，即便在同一蛋白质内也是如此。这些发现支持老龄化驱动蛋白质功能的通路靶向调节，而非统一的全局氧化转变。此外，年龄相关的半胱氨酸氧化并非随机分布，而是靶向涉及线粒体代谢通路、肌肉功能和蛋白质稳态（proteostasis）的互连蛋白质网络，表明氧化还原信号中的协调重塑是骨骼肌老龄化的一个标志。为将蛋白质组学特征与机制联系起来，研究人员使用AlphaFold3（AlphaFold3）模拟渐进性半胱氨酸氧化并预测结构结果。随后使用HADDOCK（HADDOCK）进行蛋白质对接模拟。该方法用于优先考虑数据集中识别的功能重要半胱氨酸。这些结果表明，骨骼肌老龄化驱动生理相关半胱氨酸基氧化还原信号网络的选择性重连。通过整合氧化还原蛋白质组学与基于AI的结构模拟，本研究提供了一个框架，以优先考虑关键的氧化敏感半胱氨酸（包括26^S蛋白酶体（26S proteasome）内的），作为肌少症的潜在机制节点和干预靶点。

**研究背景与问题**
老龄化导致骨骼肌质量和力量进行性丧失（肌少症，sarcopenia），同时伴随氧化还原稳态（redox homeostasis）失衡。尽管活性氧物种（reactive oxygen species，ROS）在衰老中的作用已被长期关注，但试图通过增强抗氧化能力延长寿命的努力效果有限，提示衰老并非简单的氧化损伤累积。氧化还原信号（redox signalling）通过半胱氨酸（cysteine）残基的可逆氧化调控蛋白质功能，对肌肉适应至关重要。然而，老龄化如何破坏基于半胱氨酸的位点特异性调控机制仍不清楚。本研究旨在利用OxiMouse数据集（OxiMouse dataset）绘制骨骼肌中年龄相关的半胱氨酸氧化图谱，并结合人工智能（AI）模拟关键残基的氧化修饰，预测结构及功能后果，从而揭示老龄化中氧化还原信号的重塑模式及其与肌少症的联系。该论文发表在《Experimental Physiology》。

**研究内容与结论**
研究人员对年轻（16周）和年老（80周）C57BL/6J小鼠骨骼肌中半胱氨酸氧化数据进行位点特异性统计分析，筛选显著差异氧化位点（|Δ氧化度|≥10%，FDR<0.05）。通过基因本体（Gene Ontology，GO）分类和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，并结合BioPlex 3.0蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，发现年龄相关氧化修饰并非随机分布，而是靶向线粒体代谢、肌肉收缩和蛋白质稳态（proteostasis）相关互连网络。进一步，利用AlphaFold3（AlphaFold3）模拟野生型、突变型及渐进氧化态的结构，并用HADDOCK（HADDOCK）进行蛋白质对接模拟，优先识别功能重要的氧化敏感半胱氨酸，包括超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）二硫键相关位点、26^S蛋白酶体（26S proteasome）ATP酶亚基PSMC1/PSMC2及肌球蛋白轻链6（myosin light chain 6，MYL6）等。结论表明，老龄化驱动选择性、位点特异性的半胱氨酸氧化重塑，而非全局氧化转变；整合氧化还原蛋白质组学与AI结构模拟可优先筛选氧化敏感半胱氨酸作为肌少症的机制节点及潜在干预靶点。

**关键技术方法**
数据来源于OxiMouse平台（C57BL/6J小鼠骨骼肌，每组5个生物学重复），包含可逆半胱氨酸氧化（亚磺酸状态）的定量数据。采用Welch风格伪t检验结合Benjamini-Hochberg错误发现率（false discovery rate，FDR）校正进行差异分析。功能注释使用GO（org.Mm.eg.db包）和KEGG（clusterProfiler包）富集分析。蛋白质互作网络基于BioPlex 3.0（人类互作组，通过Ensembl BioMart进行人鼠同源转换）。结构模拟使用AlphaFold3（默认设置），蛋白质对接使用HADDOCK 2.4，以HADDOCK评分、聚类大小、均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）等指标评估。

**研究结果**
**3.1 氧化还原调控高度特化和上下文依赖**
通过火山图对比年轻与年老小鼠骨骼肌中半胱氨酸氧化差异，并映射至GO类别，发现线粒体、蛋白质稳态、炎症信号及核酸代谢等相关通路呈现异质性年龄相关氧化模式。同一蛋白质内不同半胱氨酸位点氧化程度不同，如辅酶Q10A（COQ10A）的Cys129和Cys173氧化差异显著；组织蛋白酶B（cathepsin B，CTSB）的Cys59、Cys211和Cys319在年龄间呈现不同氧化模式。进一步分析氧化度>20%的半胱氨酸周围±4位氨基酸组成，发现碱性残基（尤其是精氨酸）富集、酸性残基（天冬氨酸、谷氨酸）缺失，且存在年龄特异性差异。三维结构分析（如己糖激酶1（HK1）、线粒体转录延伸因子（TEFM）、NADH脱氢酶[泛醌]1α亚复合物亚基2（NDUFA2））表明，空间电性环境在半胱氨酸氧化选择性中起关键作用。

**3.2 年龄相关半胱氨酸氧化揭示协调的蛋白质相互作用网络和通路重塑**
将含有显著差异氧化半胱氨酸的蛋白质映射至BioPlex 3.0 PPI网络，显示广泛互连性，提示非随机聚类。KEGG通路富集分析显示，三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环、脂肪酸代谢、过氧化物酶体、蛋白酶体、铁死亡、肌细胞骨架及神经退行性疾病通路显著富集。TCA循环中多个核心酶（如二氢硫辛酰胺脱氢酶（DLD）、异柠檬酸脱氢酶亚型（IDH1/2/3G）、丙酮酸羧化酶（PC）、琥珀酸脱氢酶亚基C（SDHC）、琥珀酰辅酶A连接酶亚基G2（SUCLG2））呈现协调氧化。肌小节蛋白（如肌球蛋白重链（MYHs）、肌球蛋白结合蛋白C（MYBPC）、肌联蛋白（TTN）、伴肌动蛋白（NEB）、细丝蛋白C（FLNC）、LIM结构域蛋白等）及运动蛋白（如MYL6、MYH10/14、MYO18A）显示广泛氧化修饰。蛋白酶体亚复合物（如ADRM1、PSMA5、PSMC1/2、PSMD1/2）同样呈现协调氧化。

**3.3 整合氧化还原蛋白质组学与AI建模可优先考虑氧化敏感半胱氨酸作为肌少症的机制和干预靶点**
- **3.3.1 SOD1二硫键网络年龄相关重塑预测扰动金属位点微环境**：SOD1中Cys57与Cys146形成关键二硫键，稳定β-桶结构。年老肌肉中Cys146氧化降低，可能不利于二硫键形成。AlphaFold3构建非氧化活性突变体（C6A/C57A/C146A）及亚磺酸/磺酸氧化态模型，发现突变体虽整体折叠保守，但二硫键区域及金属位点周围出现局部变化，如Cu/Zn间距和配体几何轻微扰动；而过氧化态模型未导致明显构象变化。
- **3.3.2 保守C端半胱氨酸稳定19S ATP酶环中PSMC1–PSMC2界面**：年老肌肉中PSMC1 Cys399和PSMC2 Cys389氧化降低，这两个位点位于C端保守区域。AlphaFold3构建非氧化活性突变体（C399A/C389A），HADDOCK对接显示突变体界面面积减小、去溶剂化能不利、约束违反增加，表明这些半胱氨酸对稳定亚基界面起关键结构作用。
- **3.3.3 MYL6中埋藏半胱氨酸调节MYL6–MYO18A对接的能量景观而不消除结合**：年老肌肉中MYL6 Cys32氧化降低，该位点埋藏于蛋白核心。AlphaFold3构建野生型和突变体（C32A），HADDOCK对接模拟显示两种复合物均形成明确簇，但突变体表现出范德华力降低、去溶剂化罚值升高及静电作用增强，表明Cys32突变改变相互作用能量组成但不破坏结合。

**讨论总结与结论翻译**
讨论指出，研究发现支持老龄化通过选择性氧化离散半胱氨酸残基重塑氧化还原景观，而非全局氧化漂移，且氧化修饰靶向线粒体代谢、肌肉收缩和蛋白质稳态相关互连网络。邻近氨基酸环境（碱性残基富集、酸性残基缺失）影响氧化敏感性，但三维结构及组织特异性因素更为关键。SOD1、PSMC1/2和MYL6等案例展示了AI结构模拟在优先识别功能重要氧化敏感位点中的应用，特别是首次发现26^S蛋白酶体AAA+ ATP酶亚基中半胱氨酸依赖的氧化还原机制。研究还强调OxiMouse数据的快照局限性，提出未来应发展时间分辨的氧化还原动力学推断方法（如贝叶斯框架）以捕获动态调控。

**结论部分翻译**：所呈现的数据将半胱氨酸氧化重塑确定为骨骼肌老龄化中一个机制性信息丰富且生理相关的标志。老龄化并非反映全局氧化转变，而是优先重构嵌入线粒体代谢、肌肉收缩和蛋白质稳态中的离散氧化敏感节点。这突显了一种潜在机制，即改变的氧化还原信号可能影响维持骨骼肌功能的生理过程。通过整合位点解析的氧化还原蛋白质组学与基于结构模拟，该方法能够超越对氧化残基的目录化，生成可检验的机制假说，包括26^S蛋白酶体核心AAA+ ATP酶装置中的一个候选氧化敏感半胱氨酸。重要的是，这种整合提供了一条潜在的转化路径：将氧化还原蛋白质组学与AI驱动的结构模拟相结合，可优先筛选氧化敏感半胱氨酸作为肌少症的机制节点和候选干预靶点。最后，本研究强调了一个关键的方法学机遇：从快照式氧化还原蛋白质组学迈向时间分辨、定量推断氧化还原动力学，从而严格检验半胱氨酸开关是否作为功能变化的因果驱动因素跨越生物学背景。