功能化仿生支架用于人源性听觉神经回路构建

《Advanced Science》：Functionalized Biomimetic Scaffolds for Human-Derived Auditory Neural Circuit Construction

　　

听觉回路损伤导致感音神经性听力损失。然而，人内耳组织的稀缺严重阻碍了保护听觉功能的疗法开发，因此迫切需要可靠的体外模型。虽然人源性神经回路具有治疗潜力，但生成高纯度、功能成熟的螺旋神经元（spiral ganglion neurons, SGNs）并实现其定向整合仍然是重大挑战。在本研究中，研究人员成功将人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）分化为与体内对应物高度相似的SGN样神经元。使用具有高度有序拓扑结构的导电仿生支架促进了SGN样神经元的成熟和定向生长。此外，通过将SGN样神经元与去神经支配的耳蜗组织共培养，研究人员建立了一个能够模拟听觉神经回路的人源性体外模型。研究人员在仿生支架上高效重现了体外听觉神经回路，阐明了SGN样神经元成熟背后的转录变化，并再现了顺铂（cisplatin）诱导的听觉回路损伤的保护表型。这些结果表明，所构建的人源性体外神经回路模型是一个可靠且具有广阔应用前景的药物筛选平台。

**论文解读文章**

**研究背景与现存问题**
听力损失是全球最常见的感官障碍之一，世界卫生组织预计到2050年将有近25亿人受不同程度影响，其中绝大多数为感音神经性听力损失，病因包括耳毒性药物、噪声暴露和基因突变。听觉回路（auditory circuit）由感觉毛细胞、螺旋神经元（spiral ganglion neurons, SGNs）及其中枢突触连接构成，其损伤是导致不可逆听力丧失的主要原因。然而，人内耳组织极度稀缺，严重制约了保护听觉功能的疗法开发，亟需可靠的体外模型。尽管动物模型和二维细胞培养为听觉系统发育与病理研究提供了重要见解，但无法完全再现人特异性的听觉回路特征。尤其缺乏能够重建功能性、多层次听觉连接的体外平台，这极大限制了耳毒性损伤机制的研究和候选疗法的临床转化。

**研究目的与意义**
研究人员提出并构建了一种基于导电仿生支架的人源性听觉回路模型，该模型具有确定的拓扑组织和功能成熟度，可用于探究听觉回路的保护机制。论文发表在《Advanced Science》。该模型不仅为研究SGN连接性、回路动力学和损伤修复机制提供了新技术方案，还为药物筛选和疗效验证提供了可靠工具，对听力损失防治策略的开发与临床转化具有重要意义。

**主要关键技术方法**
研究人员开发了以下关键方法：①内耳类器官分化：通过分步调控BMP、FGF、WNT、SHH等信号通路，将人诱导多能干细胞（hiPSCs）定向诱导为内耳类器官，再经TrypLE消化获得高纯度SGN样神经元。②导电仿生支架制备：将Ti₃C₂T_x MXene纳米片整合到GelMA水凝胶中，通过光掩模制备具有高度对齐拓扑结构的导电支架（GelMA-MXene）。③共培养系统：将SGN样神经元与经机械去神经处理的FVB小鼠耳蜗基底膜（毛细胞保留）在支架上共培养。④转录组测序（RNA-seq）：对培养于TCP、GelMA和GelMA-MXene支架上的SGN样神经元进行全局转录组分析。⑤药物损伤与保护实验：使用顺铂（cisplatin）诱导损伤，地塞米松（dexamethasone, DEX）预处理评估保护效果。

**研究结果**
**2.1 从hiPSCs生成人SGN样神经元**
通过模拟人内耳发育过程中的细胞间信号，分步调控BMP、FGF、TGF、WNT、SHH通路，使hiPSCs高效分化为SGN样神经元。免疫荧光检测显示TUJ1、NEUROD1、PROX1、MAP2等神经元标志物阳性，并表达SGN标志物PRPH、ISL及谷氨酸能SGN特征性基因VGLUT3和GLUA2。qPCR证实SGN样神经元中上述基因显著上调，且呈现典型双极形态，占比超过50%。

**2.2 仿生支架实现SGN样神经元定向投射**
通过LiF/HCl刻蚀Ti₃C₂T_x获得单层MXene纳米片，再与GelMA水凝胶复合制备导电仿生支架。SEM显示支架具有大面积高度对齐的拓扑结构。XRD、拉曼光谱、XPS和EDX证实MXene的成功制备及元素组成。力学测试表明GelMA-MXene支架机械性能优于纯GelMA。

**2.3 仿生支架引导SGN样神经元定向生长与成熟**
SGN样神经元在TCP上呈无序生长，而在GelMA-MXene支架上则沿同一方向（0°和180°）整齐排列，且神经突长度显著增加。MXene的掺入使神经元生长锥的丝状伪足数量增多。CCK-8实验确定300 μg/mL MXene为最佳浓度。

**2.4 仿生支架促进SGN样神经元突触发育与钙活动**
培养14天后，GelMA-MXene支架上SGN样神经元中突触后密度蛋白95（PSD95）和突触素1（SYP1）的共定位点密度显著增加，表明突触成熟。钙成像显示，与TCP和GelMA组相比，GelMA-MXene组神经元钙振荡幅度和频率显著升高，周期缩短，提示电活性增强。

**2.5 转录组解析MXene介导的SGN样神经元分化与功能成熟**
RNA-seq主成分分析显示TCP、GelMA和GelMA-MXene组明显分离。与GelMA相比，GelMA-MXene组中关键神经元命运和突触基因（如NEUROG2、GRIA2、GABRA5）上调，GO富集显示神经元命运决定、多巴胺能分化和离子通道活性。GSEA分析表明神经祖细胞定型通路富集，核糖体生物合成和氧化磷酸化通路被抑制。

**2.6 建立体外人源性听觉回路模型**
将SGN样神经元与去神经小鼠耳蜗基底膜共培养于GelMA-MXene支架上，7天后SGN样神经元轴突定向伸向毛细胞，hNFL和MYO7A双染显示形成直接接触。14天后CtBP2（突触前）和PSD95（突触后）共定位，证实功能突触形成。在药物筛选中，15 μM顺铂处理24小时导致SGN样神经元显著丢失，80 nM地塞米松预处理6小时可提供保护，并增强轴突与毛细胞的接触。

**总结与结论**
研究人员成功开发了培养人源性SGN样神经元的方法，并利用拓扑结构导电仿生材料构建了体外人源性听觉神经回路模型。该工程化系统支持SGN样神经元的存活、定向生长和成熟，促进突触发育与功能精化，表现为突触后蛋白表达增加和钙信号动力学增强。转录组分析表明导电支架调控神经元成熟、突触组织和电活动相关基因网络。将人SGN样神经元与耳蜗毛细胞在受控共培养环境中整合后，重建的回路忠实模拟了SGN样神经元与毛细胞的相互作用。药物损伤与保护实验证明该模型可靠模拟听力损伤和治疗反应。总之，该听觉回路模型可作为研究听觉回路发育、突触连接和退变机制的平台，也可用于药物筛选，特别是评估耳毒性和潜在听觉神经保护疗法。