《Advanced Science》：Single-cell Transcriptome Profiling Reveals Gene Regulatory Networks and Key Genes in the Root Epidermis and Cortical Cells Associated with Early Nodulation in Glycine Max
编辑推荐：
豆科作物大豆与根瘤菌形成共生关系，在称为根瘤的特化器官中固定大气中的氮（N）。然而，在根表皮早期感染和根皮层中结节原基形成以促进正常结节形成的调控机制在大豆中仍不清楚。在此，研究人员报告了在接种后4天（一个结节自主调控和结节原基形成的重要控制点）模拟接种和根瘤
豆科作物大豆与根瘤菌形成共生关系，在称为根瘤的特化器官中固定大气中的氮（N）。然而，在根表皮早期感染和根皮层中结节原基形成以促进正常结节形成的调控机制在大豆中仍不清楚。在此，研究人员报告了在接种后4天（一个结节自主调控和结节原基形成的重要控制点）模拟接种和根瘤菌接种的大豆根的单细胞转录组分析。研究人员分析了21,500个细胞，检测到12个主要细胞簇，并鉴定了193个感染细胞特异性、205个表皮特异性和180个皮层特异性差异表达基因（DEGs）。基因本体（GO）富集和基因调控网络分析揭示了关键通路，如活性氧（ROS）介导的激素信号，参与协调防御信号和共生通路。研究人员还鉴定并功能验证了一个乙烯激活的回路，该回路包含GmWRKY6.3/6.4转录因子和选定的下游GmNod19靶基因，这些基因在早期结瘤过程中通过促进侵染线形成作为正调控因子，从而塑造结节形成。这项研究展示了单细胞转录组学和基因调控网络如何为鉴定和表征先前未被重视的调控回路提供假设，拓宽了研究人员对共生建立背后精确遗传控制的理解，并强调了结瘤基因在豆科植物中发生的功能分化。
**论文解读：单细胞转录组揭示大豆根表皮与皮层细胞早期结瘤的基因调控网络与关键基因**
**1. 研究背景与问题**
大豆（*Glycine max* L. Merrill）是重要的经济豆科作物，其与根瘤菌（*Bradyrhizobium japonicum*）共生形成根瘤，固定大气氮，减少对氮肥的依赖。尽管已有大量研究鉴定共生固氮（SNF）相关基因，尤其在模式豆科植物蒺藜苜蓿（*Medicago truncatula*）和百脉根（*Lotus japonicus*）中，但大豆作为形成有限结节的作物，其早期感染事件（如根毛卷曲、侵染线形成、皮层结节原基发生）的调控机制仍不清楚。传统批量RNA-seq（bulk RNA-seq）会掩盖细胞类型特异性信号，难以精确定位关键调控节点。因此，本研究利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）在接种后4天（4 dpi）这一结节自主调控与结节原基形成的关键时间点，解析大豆根表皮和皮层细胞的转录组，以揭示早期结瘤的分子机制。
**2. 研究内容与结论**
研究人员对接种根瘤菌（N组）和模拟接种（R组）的大豆根样本进行scRNA-seq，构建了包含21,500个细胞的单细胞图谱，鉴定出12个细胞簇，包括感染细胞、表皮细胞和皮层细胞等。通过差异表达基因（DEG）分析和基因调控网络（GRN）构建，发现表皮和皮层细胞中DEG数量最多，且乙烯信号通路在GRN中富集。功能验证表明，乙烯激活的转录因子GmWRKY6.3/6.4通过直接结合并激活下游靶基因GmNod19-19/23，促进侵染线形成，正向调控结节发生。该研究发表在《Advanced Science》，揭示了单细胞转录组学鉴定早期结瘤关键调控回路的可行性，并强调了乙烯信号在豆科植物共生建立中的复杂作用，以及Nod19基因家族在大豆中的功能分化。
**3. 主要关键技术方法**
（1）单细胞RNA测序（scRNA-seq）：使用10X Genomics平台，对大豆品种Williams 82在4 dpi的根制备原生质体，捕获21,500个细胞，通过UMAP降维和Leiden算法聚类，利用已知标记基因注释12个细胞簇。
（2）差异表达基因（DEG）鉴定：采用pyDEG方法比较R组与N组对应细胞类型，共鉴定1,522个DEG。
（3）基因调控网络（GRN）构建：基于58个差异表达转录因子，使用RegDiffusion算法构建GRN，识别乙烯核心模块。
（4）功能验证：通过毛状根转化（RNAi和过表达）、ChIP-qPCR、EMSA、双荧光素酶报告基因、BiFC、Y2H等实验验证GmWRKY6.3/6.4对GmNod19的调控。
（5）表型分析：GUS染色观察侵染点和侵染线，乙烯药理处理（ACC和AVG）及ACS基因RNAi分析乙烯与结瘤的关系。样本来源为大豆品种Williams 82，根瘤菌为*B. japonicum* USDA110。
**4. 研究结果**
**2.1 建立大豆根早期共生单细胞转录组图谱**
通过scRNA-seq在4 dpi获得12个细胞簇，包括感染细胞（仅在N组富集）、表皮细胞、皮层细胞等。感染细胞占N组12.9%，皮层细胞（19.4%）和表皮细胞（7.5%）丰度较高，为后续分析提供统计学基础。
**2.2 细胞类型特异性和物种特异性响应**
在11个共享细胞簇中鉴定1,522个DEG，66.7%为细胞类型特异性。表皮细胞（397个DEG）和皮层细胞（360个DEG）数量最多。GO富集分析显示，表皮DEG主要富集于解毒和蛋白稳态，而皮层DEG富集于运输、呼吸、氧化还原缓冲及激素信号（如乙烯）。感染细胞特异性DEG富集于种间相互作用、防御调节等，表明其处于独特的共生过渡状态。跨物种比较发现，大豆与苜蓿、百脉根在皮层细胞中共享部分通路，但存在物种特异性调控。
**2.3 构建早期共生的基因调控网络**
58个差异表达转录因子中，乙烯响应因子（ERF）类最丰富（15.6%）。GRN分析显示一个以乙烯为核心的模块，与茉莉酸（JA）、水杨酸（SA）和油菜素内酯广泛连接；另外两个分支分别涉及生长素和缺氧响应。激素串扰分析表明乙烯-JA和乙烯-SA相互作用最频繁。基于GRN，发现GmWRKY6.3/6.4可能调控GmNod19-19和GmNod19-23。
**2.4 验证GmWRKY6.3/6.4对GmNod19的调控**
ChIP-qPCR和EMSA证实GmWRKY6.3直接结合GmNod19-19和GmNod19-23启动子，而GmWRKY6.4仅结合GmNod19-23；BiFC和Y2H显示两者互作，双荧光素酶实验表明GmWRKY6.4通过GmWRKY6.3间接激活GmNod19-19。
**2.5 GmWRKY6.3/6.4和GmNod19-19/23主要作用于侵染线形成**
过表达这四个基因均增加结节数，RNAi则减少，其中GmNod19-23效果最显著。时间表达谱显示GmNod19-23在2 dpi迅速上调，7 dpi下降。标记基因分析表明其影响侵染线形成标记（GmRj1和GmRj5），而非前感染信号或结节原基。GUS染色证实RNAi显著减少侵染点和侵染线。
**2.6 GmWRKY6.3/6.4和GmNod19-19/23对乙烯响应**
外源ACC处理上调这四个基因，AVG处理下调。乙烯合成基因GmACS1和GmACS2的RNAi降低乙烯水平，并下调该回路，减少结节数。但不同品种（Williams 82、齐黄34、东农50）对乙烯处理反应不同，表明乙烯效应呈品种依赖性。
**2.7 Nod19家族进化**
系统发育分析显示Nod19家族在豆目（Fabales）中扩张，但大多为不表达的转座子介导的拷贝。仅GmNod19-19/23所在亚家族在多个物种中保守，且启动子区域含有W-box基序，与WRKY结合相关。家族扩增主要源于局部重复和转座子插入，导致组织特异性表达差异。
**5. 讨论与结论**
本研究通过scRNA-seq揭示了细胞类型特异性GRN，证明乙烯通过激活GmWRKY6.3/6.4-GmNod19回路促进早期感染。乙烯在结瘤中作用复杂，可影响防御与发育的平衡，而该回路作为更近端调控节点，对侵染线形成至关重要。Nod19家族在大豆中扩增，但功能分化主要由启动子区差异驱动。研究结论如下：集体数据表明，scRNA-seq可用于构建细胞类型特异性GRN并鉴定参与大豆根早期根瘤菌感染建立共生的通路和基因。GRN中的转录因子和DEGs是未来假设驱动功能研究的理想候选，以推进对共生对话的理解。
