靶向神经元的外泌体递送抗RIPK3 siRNA延缓阿尔茨海默病神经退行性进展

《Advanced Science》：Neuron-Targeted Exosomal Delivery of siRNA Against RIPK3 Slows Neurodegenerative Progression in Alzheimer's Disease

　　

中枢神经系统疾病RNA治疗药物面临的主要挑战在于缺乏能够跨越血脑屏障(BBB)同时实现细胞类型特异性靶向的递送系统。研究人员在此开发了一种工程化外泌体siRNA递送平台，用于系统性、神经元靶向的RNA脑部转运。该平台利用永生化小鼠海马神经元细胞系来源的外泌体作为仿生且功能特权的材料来源，增强神经元摄取及细胞内递送效率。通过在表面功能化狂犬病病毒糖蛋白衍生肽，该系统实现了受体介导的BBB跨胞吞作用及可编程siRNA装载。在人皮层类器官中，该平台在神经元中实现了高效的胞质递送及稳健的基因沉默，展现出高递送精度和生物利用度。作为概念验证，靶向受体相互作用蛋白激酶3(RIPK3)可调节坏死性凋亡，这是炎症性神经退行中的关键通路。在转基因小鼠模型中，系统性给药抑制了RIPK3/MLKL信号传导，减少了神经元丢失，并减轻了神经炎症及tau相关病理。转录组学分析进一步表明脆弱脑区的神经元稳态趋于稳定。总之，该研究建立了一个模块化且可编程的外泌体RNA递送平台，并强调了年龄定义的、细胞来源的生物材料作为克服神经疾病递送障碍的通用策略。

研究背景方面，阿尔茨海默病(AD)在中重度阶段仍缺乏有效的疾病修饰疗法。尽管靶向淀粉样蛋白β(Aβ)的免疫疗法在早期显示出获益，但随着疾病进展至广泛神经元丢失和脑萎缩阶段，其临床疗效急剧下降。一旦神经退行性变启动，聚焦于上游病理聚集体（如Aβ）的策略显得不足，保护神经元存活和环路完整性成为晚期AD亟待满足的治疗重点。积累的证据表明AD中的神经元死亡是主动调控的过程，其中坏死性凋亡（一种程序性细胞死亡）在神经退行中发挥有害作用。不同于凋亡，坏死性凋亡导致细胞裂解并释放损伤相关分子模式(DAMPs)，激活小胶质细胞并加剧神经炎症恶性循环，其核心由受体相互作用蛋白激酶1和3(RIPK1/RIPK3)通过磷酸化混合谱系激酶样蛋白(MLKL)执行。AD脑中RIPK1/RIPK3活性升高与tau病理和神经元损伤相关。靶向上游RIPK1因存在支架功能安全顾虑受限，而RIPK3作为坏死性凋亡更特异的执行节点成为潜在靶点，但目前缺乏中枢神经系统内细胞类型特异性的RIPK3抑制策略。小干扰RNA(siRNA)虽能高效基因沉默，但跨越血脑屏障(BBB)递送治疗性siRNA仍是巨大障碍，传统合成纳米载体难以兼顾BBB转运、神经元靶向和长期生物相容性，病毒载体有免疫原性，脂质纳米颗粒(LNPs)BBB穿透差且脱靶蓄积。内源性外泌体具低免疫原性、体液稳定性和固有BBB跨越能力，表面工程化靶向配体（如狂犬病病毒糖蛋白(RVG)肽）可结合神经元烟碱型乙酰胆碱受体实现受体介导的BBB转胞吞及神经元靶向，为此提供了新思路。本研究旨在报道一种神经元靶向的外泌体RNA干扰策略以抑制AD中的坏死性凋亡，评估工程化RVG功能化外泌体装载抗Ripk3 siRNA（si-Ripk3@Exo^RVG）在转基因小鼠模型和人类多能干细胞衍生的皮层类器官中的疗效，确立坏死性凋亡作为晚期AD可干预的治疗轴，并建立工程化外泌体作为脑部精准RNA递送的可扩展纳米技术框架。该研究发表于《Advanced Science》。

作者开展研究用到的主要关键技术方法包括：基于人额叶皮层队列（GSE122063，含44例AD和56例年龄匹配对照）的转录组数据分析采用单样本基因集富集分析(ssGSEA)；体外血脑屏障(BBB)模型采用Transwell共培养体系（bEnd.3脑微血管内皮细胞、MBVP周细胞、星形胶质细胞）并检测跨内皮电阻(TEER)；外泌体表征采用纳米颗粒追踪分析(NTA)、透射电镜(TEM)及Western blot检测标志物（TSG101、CD63、Calnexin）；细胞摄取与胞内定位采用荧光共聚焦显微镜及Pearson相关系数分析；基因沉默效率采用定量PCR(qPCR)及Western blot检测磷酸化蛋白（pRIPK3 Ser232、pMLKL Ser358/S345）；体内实验采用FAD3T（APP/PS1/Tau）转基因小鼠模型进行尾静脉给药及行为学评估（筑巢、旷场、新物体识别NOR、Morris水迷宫MWM）；活体成像采用DiR标记外泌体追踪脑部蓄积；组织学分析采用免疫荧光（NeuN、GFAP、pTau等）及H&E染色；转录组学采用RNA测序及GO、KEGG富集分析；人皮层类器官由人诱导多能干细胞(hPSCs)分化构建并采用10%正常人血清诱导散发性AD样模型进行干预验证。

研究结果部分保留原文小标题并简述结论如下。

2.1 Tau病理通过RIPK3依赖性坏死性凋亡驱动神经元损伤。研究人员通过对GSE122063数据集ssGSEA分析发现AD患者额叶皮层中RIPK3/MLKL相关坏死性凋亡基因特征显著上调；在FAD3T小鼠皮层和海马观察到神经元丢失及pRIPK3、pMLKL阳性细胞增加；体外OA诱导HT22细胞tau过度磷酸化（pTau/Tau比值升高）同时伴随RIPK3和MLKL磷酸化，证实tau病变足以激活神经元坏死性凋亡信号，支持RIPK3是比MLKL更可行的治疗靶点。

2.2 RVG富集的海马神经元来源外泌体的开发与表征。研究人员通过慢病毒包装RVG-Lamp2融合蛋白建立稳定表达RVG-Lamp2的HT22细胞系(HT22-RVG)并收获工程化外泌体(Exo^RVG)。NTA显示Exo与Exo^RVG平均直径约140 nm，TEM确认典型杯状囊泡形态，Western blot确认阳性表达TSG101、CD63且阴性表达Calnexin，表面zeta电位无显著差异，表明RVG工程化未改变神经元源外泌物理化性质。

2.3 Exo^RVG高效靶向并进入神经元细胞。研究人员在Transwell BBB模型中验证PKH26标记Exo^RVG约53.07%穿透至基底侧（脑实质侧）；共聚焦显示Exo^RVG被HT22神经元高效内化而HEK293T摄取极少，具神经元偏好性；CCK-8证实高达20 μg浓度下无细胞毒性，具备良好生物相容性。

2.4 Exo^RVG封装si-Ripk3抑制体外神经元坏死性凋亡。研究人员筛选获得si-Ripk3-883约50%敲低Ripk3 mRNA，电穿孔装载2'-O-甲基(2'-OMe)修饰si-Ripk3至Exo^RVG，装载量约0.98 pmol μg^-1蛋白，包封率36%-38%。在OA诱导的HT22细胞中，si-Ripk3@Exo^RVG有效抑制Ripk3上调、恢复细胞活力并降低pRIPK3和pMLKL荧光强度，阻断坏死性凋亡信号。

2.5 si-Ripk3@Exo^RVG通过高效胞质递送与协调抑制坏死性凋亡信号挽救神经元活力与功能。CCK-8显示si-Ripk3@Exo^RVG完全恢复OA处理HT22细胞活力；共聚焦与Pearson系数分析表明siRNA与溶酶体重叠显著降低，实现有效内体逃逸至胞质；Western blot显示pMLKL(Ser358)下调，RIPK1/Pro-Caspase-8比值降低，转向抗坏死性凋亡状态；空Exo^RVG仅有轻微保护，预封装复合物疗效显著优于游离siRNA与空外泌体混合物，具协同效应；活体成像显示DiR-Exo^RVG尾静脉给药6小时脑蓄积达峰，优于游离siRNA且24小时信号减半，具良好代谢清除谱。

2.6 si-Ripk3@Exo^RVG延缓FAD3T小鼠认知与记忆衰退进展。研究人员对3月龄FAD3T小鼠每3天尾静脉给予1 mg/kg siRNA剂量si-Ripk3@Exo^RVG。行为学显示治疗组筑巢评分接近野生型(WT)、直立频率恢复；新物体识别中辨别指数(DI)和偏好指数(PI)显著提升；Morris水迷宫探针测试中目标象限停留时间及平台穿越次数增加，首次进入原平台潜伏期缩短，表明海马依赖的学习记忆功能得到挽救，si-Ripk3@Exo^RVG延缓认知衰退。

2.7 siRNA@Exo^RVG的细胞毒性与体内生物相容性评估。Kaplan-Meier生存分析显示治疗组死亡率风险显著降低(HR=0.1960)，与WT无差异；血浆生化(ALT、AST、BUN、UA、CR)无异常；肝肾功能及炎症因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)无升高；心肝脾肺肾H&E未见坏死纤维化及炎性浸润；脑组织H&E无炎症反应，连续15次给药未诱发主要脏器细胞毒性，具优异体内生物相容性。

2.8 si-Ripk3@Exo^RVG减轻FAD3T小鼠坏死性凋亡并减弱pTau相关神经毒性。免疫荧光显示治疗组海马皮层NeuN阳性神经元密度显著增加；pRIPK3阳性细胞从28.48%降至12.19%，pMLKL从24.42%降至12.45%；突触标记PSD95表达恢复；GFAP免疫反应性降低，星形胶质细胞分支点和胞体面积减少，小胶质细胞形态改善；pTau(Thr202/Ser205)显著减少，表明抑制坏死性凋亡同时缓解tau病理。

2.9 si-Ripk3@Exo^RVG重编程神经元转录组以抑制神经炎症并维持AD突触功能。海马RNA测序显示治疗组大量失调基因部分或完全归一化，GO分析富集于突触组织、神经元存活、信号转导（Tulp1、Slitrk6上调，Hmox1、Icam1、Tnf、Bag3下调）；KEGG显示NF-κB、TNF、IL-17、MAPK通路衰减，cGMP-PKG、GABA能突触、突触小泡周期相关基因(Adra2b、Kcnmb3等)上调；皮层转录组一致；Western blot验证p38 MAPK磷酸化降低，VASP磷酸化改变，证实转录重编程与功能通路调控吻合。

2.10 基于人皮层类器官的Exo@si-Ripk3疗效验证。研究人员构建hPSCs来源皮层类器官具分层结构与神经干增殖，10%正常人血清诱导AD样模型（pTau、Aβ、坏死性凋亡、炎症）。采用HEK293T-RVG来源Exo^RVG装载si-Ripk3-1352（沉默~70%）处理，显著抑制pRIPK3信号及反应性胶质增生(GFAP)，突触蛋白GRIA1/MAP2比值恢复，虽pTau降低未达统计显著，但在功能水平挽救突触完整性，证明在人类皮层微环境中RIPK3沉默可重塑病理环境至功能稳态。

讨论部分总结：研究人员指出AD神经退行性变是适应不良的细胞死亡程序与慢性神经炎症交织的结果，确认RIPK3介导的坏死性凋亡是连接神经元丢失与炎症放大的中枢执行节点，神经元靶向RNA干扰可有效中断该病理环路。坏死性凋亡具促炎特性，膜破裂释放DAMPs持续激活小胶质细胞加剧tau过度磷酸化；RIPK1因支架功能复杂难成药，RIPK3位于坏死性凋亡下游更受限位置，选择性抑制可阻断执行且不破坏上游稳态，且pRIPK3早期核磷酸化后胞质转位传播死亡信号。RIPK3沉默引起疾病相关转录景观广泛重编程，下调MAPK、NF-κB等炎症神经毒性通路，激活cGMP-PKG等突触支持程序，tau过度磷酸化减轻源于微环境正常化而非直接作用于tau修饰酶，体现系统层面重塑神经元生态韧性。转化角度上，抗Aβ抗体（如Lecanemab）对中度以上已广泛神经元丢失者获益有限，本研究即使在既定病理下仍提供强神经保护，延缓晚期模型认知衰退，且在人类皮层类器官验证疗效，桥接啮齿类与临床试验。递送策略上，RVG工程化外泌体利用内源性途径跨BBB及神经元特异摄取，活体成像显示时间依赖性脑富集优于LNPs，疗效源于空外泌体本底保护与siRNA基因沉默协同及高效内体逃逸至胞质。局限性包括类器官缺血管与全身免疫、长期免疫原性及脱靶需究、缺工程化EV全面组学表征、缺坏死性凋亡标记单细胞共定位，未来需非人灵长类评估安全性及联合上游疾病修饰疗法。

结论部分翻译：总之，本研究确立RIPK3介导的坏死性凋亡作为AD中神经元丢失与神经炎症之间的核心机制桥梁，并引入一种神经元靶向的外泌体RNA递送平台（si-Ripk3@Exo^RVG），能够在体内调节该通路。通过将精准分子干预与先进生物递送相结合，本工作强调了重编程退行神经元微环境的可行策略，并为晚期神经退行性疾病的RNA基疗法提供了一个转化框架。