空间转录组图谱揭示叉头框蛋白O3介导的线粒体动力学失衡驱动小鼠早发性卵巢功能不全

《Aging Cell》：Spatial Transcriptomic Atlas Reveals That Forkhead Box O3-Mediated Mitochondrial Dynamics Imbalance Drives Premature Ovarian Insufficiency in Mice

　　

早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是女性生殖衰老的主要驱动因素，但其机制以及生殖衰老的空间和结构模式仍知之甚少。因此，研究人员构建了POI小鼠模型的空间转录组图谱，以定义疾病进展过程中颗粒细胞（granulosa cell，GC）衰老的空间和分子特征。空间分析揭示了卵泡结构破坏和不同的颗粒细胞亚群，这些亚群表现出分化受阻和衰老相关基因特征。整合多个基因集，确定了线粒体结构和功能损伤、过度分裂、融合减少、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）丧失、ATP产生不足和活性氧（reactive oxygen species，ROS）积累是POI中颗粒细胞衰老的核心特征。KEGG通路富集分析提示叉头框蛋白O（Forkhead box O，FOXO）信号通路调控线粒体功能障碍，且在POI中叉头框蛋白O3（Forkhead box O3，FOXO3）磷酸化显著降低。在雷公藤甲素诱导的KGN细胞POI模型中，药物抑制异常FOXO3激活可部分恢复线粒体形态和功能，而抑制正常KGN细胞中FOXO3磷酸化则诱导线粒体功能障碍。在小鼠颗粒细胞中通过腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）介导的FOXO3过表达重现了衰老表型和线粒体动力学失衡，并激活了PTEN诱导激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）/帕金蛋白（Parkin，PARKIN）介导的线粒体自噬信号。生理性衰老的10月龄小鼠卵巢表现出相同的特征——p-FOXO3减少、衰老标志物上调以及线粒体动力学紊乱——提示这是卵巢功能衰退的一个保守特征。综上所述，这些发现表明异常FOXO3通路激活破坏了线粒体动态稳态，驱动POI中颗粒细胞衰老和卵巢衰竭。通过将空间转录组学与功能和机制分析相结合，本研究建立了一个空间解析的卵巢衰老理解框架，并确定了FOXO3调控的线粒体通路作为POI的潜在诊断和治疗靶点。

**论文解读：空间转录组图谱揭示FOXO3介导的线粒体动力学失衡驱动小鼠早发性卵巢功能不全**

**研究背景与目的**

早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是指女性40岁前卵巢功能衰退，表现为月经异常、促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）升高及雌激素水平下降，全球患病率约3.5%且呈年轻化趋势。其病因复杂，涉及遗传、自身免疫、医源性和环境因素，但许多患者的致病机制尚不完全清楚。颗粒细胞（granulosa cell，GC）在卵母细胞发育、甾体激素合成及卵泡完整性维持中起核心作用，其功能障碍导致卵泡闭锁和卵母细胞成熟受损，最终引起卵巢功能衰退。已有证据表明颗粒细胞衰老参与卵巢功能障碍，但触发POI进程中颗粒细胞衰老的上游信号仍不明确。线粒体功能障碍是细胞衰老的关键标志，表现为线粒体形态改变、能量产生减少、活性氧（reactive oxygen species，ROS）增多及线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP）下降。维持线粒体功能依赖于平衡的线粒体动力学，包括裂变和融合：过度裂变导致线粒体碎片化并加速组织衰老，而增强融合有助于恢复MMP并逆转衰老表型。叉头框蛋白O3（Forkhead box O3，FOXO3）作为调节寿命和代谢的转录因子，是线粒体功能的关键上游调控因子。在应激条件下，去磷酸化的FOXO3转位至核内，调控包括线粒体动力学在内的下游基因。然而，POI发展过程中FOXO3是否通过线粒体动力学调节颗粒细胞衰老尚不清楚。传统转录组学方法无法同时解析基因表达与空间定位，而空间转录组学能够通过高通量测序直接映射组织切片中的转录本，将分子通路与特定细胞位置及组织微环境联系起来。本研究旨在利用空间转录组学探究POI发展过程中颗粒细胞的时空变化及关键调控基因，揭示FOXO3介导的线粒体动力学失衡如何驱动小鼠POI，论文发表在《Aging Cell》。

**主要技术方法**

研究人员使用雷公藤苷（tripterygium glycosides，TG）灌胃诱导8周龄雌性C57BL/6小鼠建立POI模型（n=3/组），利用10× Genomics Xenium平台（小鼠5K基因面板）进行空间转录组测序，通过无监督聚类和Monocle3伪时间分析鉴定细胞亚群并重建分化轨迹。整合空间转录组差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）与Aging Atlas数据库的衰老基因集，进行基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析及蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析。在体外使用雷公藤甲素（triptolide）处理人颗粒样肿瘤细胞系KGN建立细胞模型，并通过AKT抑制剂ipatasertib激活FOXO3、FOXO3抑制剂JY-2进行功能干预。在体内，通过卵巢囊内注射AAV9载体过表达FOXO3（AAV-FOXO3），并以空载体（AAV-NC）为对照，2周后取卵巢组织及卵丘-卵母细胞复合体（cumulus-oocyte complexes，COCs）进行后续分析。同时，比较2月龄和10月龄小鼠卵巢以评估生理性衰老。检测方法包括qRT-PCR、免疫组化、免疫荧光、透射电镜、MitoTracker染色、ATP定量、JC-1法检测MMP、DCFH-DA检测ROS、超分辨率显微镜观察线粒体形态及SA-β-gal染色等。

**研究结果**

**2.1 Xenium空间转录组学解析小鼠POI卵巢的细胞图谱与卵泡空间结构紊乱**
通过对空白对照（CON）及TG处理小鼠卵巢进行空间转录组测序，鉴定出9种主要细胞类型（卵母细胞、颗粒细胞、内皮细胞、上皮细胞、黄体细胞、巨噬细胞、基质细胞、T细胞、膜细胞）及38个亚群。与CON组相比，POI组卵巢非卵泡区域显著扩大，卵泡数量减少，颗粒细胞比例降低，闭锁卵泡增加，表明POI卵巢空间微环境严重紊乱。

**2.2 颗粒细胞分化轨迹失调驱动POI中多层衰老格局**
Monocle3伪时间分析识别出三种功能性颗粒细胞亚型：早期颗粒细胞（early GCs，EGCs，表达Amh）、壁颗粒细胞（mural GCs，MGCs，表达Kitl）和卵丘颗粒细胞（cumulus GCs，CGCs，表达Inhba）。在POI卵巢中，EGCs在早期发育阶段积累，CGCs显著耗竭，MGCs减少，导致功能性成熟颗粒细胞耗竭。GO富集显示各亚型具有特异性衰老程序：EGCs富集细胞外基质重塑（促纤维化衰老相关分泌表型，SASP）；MGCs富集ROS代谢和间隙连接组装（细胞间通讯受损）；CGCs富集减数分裂细胞周期和端粒酶活性（复制性衰老）。空间图谱显示促衰老基因（Tgfb1、Trp53、Rb1）在POI颗粒细胞层表达升高，保护性基因（Sod2、Tert）表达降低。

**2.3 POI卵巢颗粒细胞衰老伴随线粒体结构性和功能性损伤**
qRT-PCR和免疫组化证实POI组颗粒细胞中衰老标志物P21和P16表达升高。整合空间转录组DEGs与衰老基因集，鉴定出221个衰老相关基因，GO富集显示与线粒体去极化、MMP调控、ATP生物合成及能量稳态相关。MitoTracker染色显示POI颗粒细胞线粒体活性降低；ATP水平下降；DCFH-DA染色显示ROS水平升高；JC-1流式分析显示MMP降低（红/绿荧光比率下降）；透射电镜观察到POI颗粒细胞线粒体肿胀、嵴模糊或消失。

**2.4 POI卵巢颗粒细胞存在异常线粒体动力学，联合测序与数据库分析提示与FOXO3的潜在关联**
免疫组化和qRT-PCR显示，POI颗粒细胞中促裂变蛋白DRP1和MFF表达升高，融合蛋白MFN2、MFN1和OPA1表达降低。KEGG富集分析提示FOXO信号通路显著富集，PPI网络分析鉴定FOXO3、AKT1和PIK3R2为中心调控基因。免疫组化显示总FOXO3无显著差异，而磷酸化FOXO3（p-FOXO3）在POI组显著降低。

**2.5 雷公藤甲素诱导的POI细胞模型重现FOXO3激活和线粒体动力学失衡**
KGN细胞经雷公藤甲素处理后，超分辨率显微镜显示线粒体网络碎片化、面积、周长、分支长度、长宽比及形状因子均降低；ATP生成减少；JC-1染色红/绿荧光比率降低（MMP下降）；ROS增加。同时，p-FOXO3水平降低，MFN2减少，DRP1增加，与体内表型一致。

**2.6 FOXO3过度激活具有致病性，而其抑制显示治疗潜力**
正常KGN细胞经AKT抑制剂ipatasertib处理（诱导FOXO3去磷酸化激活）后，线粒体形态和功能损伤与POI细胞相似；而POI细胞经FOXO3抑制剂JY-2预处理后，线粒体网络连续性部分恢复，ATP、MMP和ROS水平改善，DRP1和MFN2表达趋于正常。这表明FOXO3过度激活直接破坏线粒体动力学，而其抑制可部分逆转病理变化。

**2.7 体内FOXO3过表达因果性驱动线粒体动力学失衡并增强线粒体自噬信号**
AAV-FOXO3卵巢内注射成功过表达FOXO3后，颗粒细胞SA-β-gal阳性区域增多，P16和P21 mRNA上调，证实诱导了衰老表型。免疫荧光显示DRP1升高，MFN2降低；超分辨率显微镜显示线粒体碎片化加剧，面积、周长等指标减少；ATP下降，MMP降低，ROS升高。同时，PINK1和PARKIN表达升高，提示激活PINK1/PARKIN介导的线粒体自噬作为补偿性质量控制反应。

**2.8 FOXO3磷酸化抑制和线粒体动力学失衡是生理性卵巢衰老的共同特征**
10月龄小鼠卵巢（生理性衰老）与2月龄相比，SA-β-gal阳性区增多，P16和P21 mRNA升高；Western blot显示p-FOXO3降低；Drp1 mRNA升高，Mfn2降低；超分辨率显微镜显示线粒体碎片化、ATP降低、MMP下降、ROS升高。这些特征与雷公藤甲素诱导的POI模型一致，表明FOXO3介导的线粒体动力学失衡是卵巢功能衰退的保守特征。

**讨论与结论**

研究讨论指出，POI卵巢呈现显著空间紊乱，卵泡区域减少而非卵泡区域扩大，这与衰老相关的结构改变类似。颗粒细胞发育阻滞和亚型特异性衰老程序揭示了空间组织异常的分子基础。线粒体动力学失衡（过度裂变、融合减少）是线粒体功能障碍的核心驱动因素，而FOXO3被鉴定为这一过程的关键转录调控因子。体外和体内实验均证明，异常FOXO3激活通过破坏线粒体动态平衡导致衰老，而药物抑制FOXO3可部分恢复线粒体功能。此外，生理性衰老的卵巢呈现相同特征，提示该机制具有保守性。研究结论部分翻译如下：综上所述，本研究构建了POI的空间转录组图谱，发现FOXO3激活可能通过破坏线粒体动力学稳态促进颗粒细胞衰老，从而加速卵巢功能衰退。生理性衰老卵巢中的类似发现提示靶向FOXO3相关通路可能是延缓卵巢衰老的潜在干预策略。由于尚未进行体内拯救实验，其治疗意义仍为初步，有待进一步验证。这些发现为理解POI发病机制提供了新的空间视角，并为未来研究提供了参考。