iPSC衍生的iNK祖细胞在未清髓及自体免疫人源化小鼠中植入并生成NK细胞

《Cell Proliferation》：iPSC-Derived iNK Progenitors Engraft and Generate NK Cells in Unconditioned and Autologous Immune Humanized Mice

　　

自然杀伤（NK）细胞在体内表现出固有的短期持久性。同种异体NK（allo-NK）细胞在免疫功能正常的患者中会触发宿主免疫排斥。淋巴清除是减轻治疗性NK细胞同种异体排斥的传统方法，但这会带来宿主免疫抑制和感染风险。为解决这些问题，研究人员验证了植入源自人类诱导多能干细胞（iPSC）的iNK祖细胞（iNKP）的概念，旨在未经预处理（即无需事先进行淋巴清除化疗或全身照射）的宿主免疫人源化小鼠体内实现iNK细胞的体内生成。研究结果表明，单次低剂量输注iNKP细胞可在未经预处理的B-NDG hIL15小鼠中成功植入并持续产生成熟的iNK细胞。此外，iPSC衍生的iNKP细胞在自体外周血单个核细胞（PBMC）人源化小鼠存在的情况下存活并生成了成熟的iNK细胞。该研究证明，自体iPSC衍生的iNKP细胞具有治疗同一患者的应用潜力，且无需事先进行淋巴清除。

论文解读：iPSC衍生iNK祖细胞在未清髓及自体免疫人源化小鼠中的植入与分化

研究背景与意义

自然杀伤（NK）细胞疗法因其良好的安全性及广谱的抗肿瘤、抗病毒和抗衰证据而备受关注。然而，目前的NK细胞来源主要依赖于供体外周血和脐带血，这限制了其临床应用。未经额外修饰的同种异体NK（allo-NK）细胞在体内增殖能力有限，且极易受到宿主免疫系统的排斥而被迅速清除。为了增强疗效，临床通常采用高剂量、反复输注组织来源的NK细胞，这不仅显著增加了成本，也降低了可行性。传统的肿瘤免疫疗法通常需要预先进行化疗或放疗等清髓性预处理，以降低肿瘤负荷并促进过继免疫细胞的存活。但这些预处理方案会引发全血细胞减少、免疫抑制、反应性骨髓生成和感染等全身毒性。此外，关于诱导多能干细胞（iPSC）衍生细胞产物的免疫原性一直存在争议，虽然已有研究表明大多数自体iPSC衍生的功能细胞不会引发免疫排斥，但其在实际免疫监视环境下的表现仍需验证。因此，本研究旨在探索一种无需清髓预处理且能在自体免疫环境下存活的新型细胞疗法。该论文发表在《Cell Proliferation》。

关键技术方法概述

研究人员首先采集健康供体的外周血并分离外周血单个核细胞（PBMC）。随后，利用重编程技术将PBMC转化为iPSC，并通过电穿孔技术对其进行工程化改造，引入CXCR4基因和荧光素酶报告基因。接着，研究人员通过定向分化技术，将工程化的iPSC诱导为高纯度的iNK祖细胞（iNKP），并在第19天通过流式细胞术分选出具有特定表型（CD45⁺CD56^?CD34⁺CD7^+/?）的细胞。在动物实验阶段，研究人员将不同剂量的iNKP细胞静脉输注到未经预处理的免疫缺陷小鼠（B-NDG）和人类白细胞介素15（hIL15）转基因小鼠（B-NDG hIL15）中。为了模拟临床自体免疫环境，研究人员还构建了PBMC人源化小鼠模型，向小鼠输注来自同一供体（自体）或HLA错配供体（同种异体）的T细胞和NK细胞。最后，研究人员利用生物发光成像（BLI）和流式细胞术动态监测细胞的植入分布、存活情况及分化表型。

研究结果

3.1 人类iPSC衍生的CXCR4-iNKP细胞在未预处理hIL15小鼠中成功植入

研究人员将工程化的iNKP细胞输注到未经预处理的B-NDG和B-NDG hIL15小鼠中。通过生物发光成像（BLI）定量分析发现，iNKP细胞仅在B-NDG hIL15小鼠中实现了显著的植入，总通量在输注后第14天达到峰值，约为8×10⁷p/s。这种生物发光信号在第52天时仍可检测到，表明iNK细胞具有持续的持久性。相比之下，缺乏人类IL-15的B-NDG小鼠未能支持iNKP细胞的植入。这证明人类IL-15对于iNKP细胞在未预处理免疫缺陷小鼠中的长期植入至关重要。

3.2 iNKP细胞能够在未预处理hIL15小鼠中生成成熟iNK细胞

为了动态监测体内iNK细胞的贡献率，研究人员收集了受体小鼠的外周血进行分析。流式细胞术分析显示，在输注后第14天，外周血中出现了明显的iPSC衍生iNK细胞群，其中超过90%的细胞表达了CD16，显示出强烈的成熟特征。这些细胞在循环中的贡献率在输注后第25至34天达到峰值。而在缺乏hIL15的对照组中未检测到这些细胞。这表明iNKP细胞不仅能在体内存活，还能进一步分化为成熟的iNK细胞。

3.3 iNKP细胞成功植入自体而非同种异体PBMC人源化hIL15小鼠

研究人员评估了iNKP细胞在免疫功能更健全的人源化小鼠中的表现。结果显示，在仅输注iNKP细胞或输注iNKP细胞联合自体T/NK细胞的小鼠体内，肺部、肝脏、骨髓和脾脏均检测到了BLI信号。然而，在输注iNKP细胞联合同种异体T/NK细胞的小鼠中，第21天的器官BLI信号几乎完全消失，离体器官分析也证实了信号的缺失。这说明iNKP细胞能够在自体免疫监视下成功植入并持续存在，但在同种异体免疫环境中会被完全排斥。

3.4 iPSC衍生的iNKP细胞在自体PBMC人源化hIL15小鼠中成功分化为成熟iNK细胞

为了区分体内分化的iNK细胞与过继转移的PBMC-NK细胞，研究人员利用人类白细胞抗原II类分子（HLA-II）作为标志物。结果发现，由iNKP细胞分化而来的iNK细胞中99.8%不表达HLA-II，而输入的PBMC-NK细胞几乎全部表达HLA-II。流式细胞术分析进一步证实，在自体免疫组小鼠的各个器官中均检测到了HLA-II阴性的iNK细胞群体，而在同种异体免疫组中则几乎不存在。这证明iNKP细胞能够在功能性自体免疫系统存在的情况下于体内分化为成熟的iNK细胞。

讨论与结论

本研究的发现代表了基于细胞的免疫疗法领域的潜在范式转变。传统的过继免疫细胞疗法历来依赖于清髓性预处理方案，而这些方案会带来显著的系统性毒性。本研究证明，表达CXCR4的iNKP细胞可以在未预处理、免疫功能正常的体内环境中归巢至骨髓微环境并分化为成熟的循环iNK细胞。这暗示着临床模型可能从“免疫消融与重建”转向“免疫共存”。通过规避淋巴清除的需求，iNKP疗法可以应用于肿瘤负荷较低或无法耐受强化预处理的患者。

在iPSC衍生产物的免疫原性争议方面，本研究的结果与以往证据一致，即源自同基因iPSC的分化细胞仅引发有限的免疫原性。自体iNKP细胞尽管存在活跃的免疫监视，仍能成功植入和成熟，这加强了个性化、患者特异性iNKP疗法作为安全有效治疗策略的可行性。然而，要将iNKP细胞转化为通用的现货型产品，克服同种异体免疫排斥仍是未来的关键挑战。

尽管结果令人鼓舞，但仍存在一些局限性。首先，研究是在人源化小鼠模型中进行的，这些模型虽然复杂，但并未完全复制人类患者免疫系统的复杂性。其次，观察时间限制在52天内，长期研究对于确定iNKP衍生细胞的最终命运至关重要。最后，IL-15对于植入的绝对必要性表明，虽然外源性淋巴清除是可避免的，但特定的细胞因子支持对于治疗的成功仍然是必不可少的。

综上所述，本研究提供的证据表明，iNKP细胞能够在未预处理和自体免疫功能正常的条件下生成iNK细胞。iNKP细胞疗法具有在不进行淋巴清除或骨髓消融的情况下治疗患者的潜力。