经典的效应子触发免疫依赖性和非依赖性通路介导由CBP60b分支功能缺失引起的自身免疫

《Molecular Plant Pathology》：Canonical ETI-Dependent and -Independent Pathways Mediate Autoimmunity Caused by Loss of CBP60b Clade Function

　　

钙调蛋白结合蛋白60（Calmodulin-Binding Protein 60，CBP60）是一个植物特有的非典型转录因子家族，在重编程植物免疫中发挥关键作用。CBP60_b及CBP60_b/c/d/e/f亚家族的功能缺失会组成性激活免疫反应（自身免疫）。然而，这种自身免疫的具体机制和通路仍不清楚。研究人员通过对cbp60_b突变体进行EMS诱变，分离出一个显性抑制子突变体，该突变抑制了cbp60_b的自身免疫表型。测序鉴定出CBP60_g中的一个点突变（命名为cbp60_g-3），该突变导致第252位的天冬氨酸被天冬酰胺取代，并降低了其转录活性。增加CBP60_g^D252N的表达恢复了cbp60_g;sard1突变体的病原反应缺陷。引人注目的是，野生型CBP60_g未能抑制cbp60_b的自身免疫，而转录活性受损的CBP60_g^D252N变体却完全抑制了它。出乎意料的是，研究人员发现，经典效应子触发免疫（effector-triggered immunity，ETI）通路的功能缺失只能部分抑制cbp60_b;c;d;e;f五重突变体的自身免疫。尽管同时破坏ETI通路和引入CBP60_g^D252N进一步抑制了cbp60_b;c;d;e;f的自身免疫，但仍未能实现完全抑制。这些结果表明，cbp60_b;c;d;e;f突变体中的自身免疫由经典的ETI依赖性和ETI非依赖性通路共同介导。这些结果为植物自身免疫的信号传导机制提供了新见解，并提出了进一步的问题。

### 论文解读：CBP60_b分支功能缺失引发的自身免疫由经典效应子触发免疫依赖性和非依赖性通路共同介导

#### 研究背景与问题
植物免疫系统通过两层防线抵御病原微生物：第一层为模式识别受体（PRRs）感知病原相关分子模式（PAMPs）或损伤相关分子模式（DAMPs），激活模式触发免疫（PTI）；第二层为细胞内免疫受体（nucleotide-binding leucine-rich repeat，NLR蛋白）识别病原效应子，触发效应子触发免疫（ETI）。NLR分为TNL、CNL和RNL三类，TNL信号依赖EDS1-PAD4或EDS1-SAG101复合体及RNLs，CNL信号则需NDR1。ETI常伴随超敏反应（HR）。此外，某些基因突变会异常激活免疫，导致自身免疫或病变模拟表型，常表现为矮化、自发叶片坏死、水杨酸（SA）升高及免疫基因组成性表达。自身免疫可源于免疫受体的功能获得突变或负调控因子的功能缺失突变，更多情况下源于被NLR监测的“守卫”蛋白（guardee）的突变。CBP60家族是植物特有的转录因子，拟南芥中有8个成员，分为CBP60a、CBP60b/c/d/e/f、CBP60g和SARD1亚支。CBP60b被认为是免疫转录重编程的关键激活因子，其突变导致自身免疫，且依赖于EDS1-PAD4和NDR1通路。CBP60g和SARD1功能冗余，调控PTI、ETI及SA信号相关基因。CBP60b–f亚支成员功能冗余，其多重突变会加剧自身免疫。然而，CBP60b功能缺失引发的自身免疫是否仅由经典ETI通路介导，或是否存在其他通路参与，仍不清楚。本论文旨在通过遗传筛选和通路解析，阐明CBP60b分支功能缺失导致自身免疫的分子机制。

#### 主要技术方法（小于250字）
1. **EMS诱变筛选**：对cbp60b突变体种子进行0.2% EMS处理，在M1代筛选形态抑制子，通过全基因组重测序鉴定突变位点。
2. **CRISPR-Cas9基因编辑**：构建靶向特定基因（如FMO1、SID2及11个NLR基因）的敲除突变体（Wang et al., 2015方法），用于通路功能丧失分析。
3. **双荧光素酶报告基因检测**：在拟南芥叶肉原生质体中共表达报告载体（proSID2:LUC或proEDS1:LUC）与效应载体（UBQ10:CBP60g-GFP或其突变体），测定转录活性（Li et al., 2021）。
4. **转录组测序（RNA-seq）**：对2周龄野生型、epn、quintuple及octuple（epn;quintuple）突变体的地上部分进行RNA-seq，以DESeq2分析差异表达基因（DEGs），并进行GO富集分析。
5. **病原菌接种实验**：用Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000浸润5周龄短日照植株，通过稀释平板计数法测定细菌增殖（CFU/cm2）。

#### 研究结果

**2.1 cbp60b的自身免疫不由SA/SAR通路或cbp60b中高表达的NLR基因介导**
通过CRISPR-Cas9在cbp60b背景中敲除FMO1或SID2（SA和SAR通路关键基因），或过表达NahG（降解SA），均未抑制cbp60b的发育缺陷。对cbp60b中转录水平上调的11个NLR基因逐一敲除，或过表达其显性负效突变体，也未能恢复表型。这表明SA/SAR通路激活和NLR基因上调是自身免疫的次级结果，而非原因。

**2.2 CBP60g^D252N抑制cbp60b的自身免疫**
通过EMS诱变获得抑制子sw-05-12，其表型抑制由CBP60g中G→A点突变（D252N）导致。将UBQ10:CBP60g^D252N-GFP转入cbp60b，可完全恢复其表型（植株大小、PR1/PR2表达），而UBQ10:CBP60g-GFP不能。同源残基突变SARD1^D259N也能挽救，但CBP60a^D241N不能，说明CBP60g和SARD1功能相似，CBP60a功能不同。内源CBP60g转录在cbp60b中组成性高表达，但在CBP60g^D252N转基因系中被抑制，而CBP60g转基因系中未抑制，表明互补作用与内源CBP60g转录水平无关。

**2.3 CBP60g^D252N的转录活性降低**
双荧光素酶报告实验显示，CBP60g^D252N诱导的LUC活性显著低于野生型CBP60g。在cbp60g;sard1双突变体中，高表达CBP60g^D252N可完全恢复对Pto DC3000的抗性，低表达仅部分恢复，提示功能可通过蛋白丰度补偿。由于CBP60g^D252N转录活性低于CBP60g，且CBP60g活性本就低于CBP60b，因此其挽救cbp60b表型并非替代CBP60b的转录功能。将该突变体引入cbp60b;c;d;e;f五重突变体后，仅部分抑制其自身免疫（图S4）。

**2.4 cbp60b;c;d;e;f的自身免疫部分依赖于经典ETI通路**
将eds1-c1;pad4-c1或ndr1-c1分别引入五重突变体，可不同程度地挽救发育表型，但均未完全抑制。同时破坏EDS1、PAD4和NDR1（epn）后，epn;quintuple突变体仍表现发育停滞（约3周后不抽苔），免疫标记基因PR1/PR2表达仍显著高于野生型。epn可完全挽救cbp60b和cbp60b;d;e;f，但对cbp60b;c仅部分挽救（植株稍小），说明CBP60c在幼苗期高表达且对自身免疫贡献更大。

**2.5 RNA-seq揭示epn;quintuple中免疫基因组成性激活**
RNA-seq分析显示，epn;quintuple（八重）突变体与野生型相比有902个上调DEGs（90.2%与五重突变体共有），GO富集于“水杨酸应答”、“防御反应”、“系统获得抗性”等免疫通路。这些上调DEGs在八重突变体中的表达水平低于五重突变体，但仍显著高于野生型，表明阻断经典ETI仅部分抑制过度免疫。下调DEGs功能不涉及免疫，且无已知导致自身免疫的基因。

**2.6 CBP60g^D252N通过非经典ETI通路抑制cbp60s的自身免疫**
将CBP60g^D252N引入epn;quintuple背景（通过杂交），可进一步减轻发育缺陷并降低PR1/PR2表达，但无法实现完全抑制。从>30个T1代转基因系中挑选最高表达系，即使在5周后仍不抽苔，且SARD1、SID2、FMO1、BKK1等免疫基因表达仍高于野生型。这表明同时引入CBP60g^D252N并破坏经典ETI通路只能部分抑制五重突变体的自身免疫。

#### 讨论与结论
本研究通过EMS筛选获得了CBP60g^D252N突变体，该突变降低了转录活性但保留了病原应答功能，且能抑制cbp60b自身免疫，而野生型CBP60g不能，说明抑制基于功能改变而非替代。五重突变体的自身免疫由经典ETI依赖性和ETI非依赖性通路共同介导：破坏EDS1/PAD4/NDR1仅部分挽救，RNA-seq显示免疫基因仍组成性激活。CBP60g^D252N进一步减轻epn;quintuple表型，但无法完全恢复，提示存在独立的ETI非依赖性通路。CBP60b分支在植物登陆时出现，可能参与发育；epn;quintuple中下调基因功能未知，不能排除发育与免疫权衡的可能性。与其他自身免疫突变体（如camta1;2;3、snc1、mpk4等）不同，cbp60b中SA/SAR通路突变不能抑制表型，且上调的NLR基因单独敲除无效，但EDS1-PAD4和NDR1突变可完全或部分抑制。这些结果揭示了CBP60家族成员调控网络的复杂性与精妙性，未来通过EMS筛选更多抑制子可能鉴定出参与该过程的免疫组分。

**翻译研究结论部分**：
本研究通过EMS诱变筛选鉴定了一个新的CBP60g突变等位基因cbp60g-3，其第252位天冬氨酸变为天冬酰胺（D252N）。该突变降低了CBP60g的转录活性，但足以补偿cbp60g;sard1突变体的病原应答缺陷。转录活性受损的CBP60g^D252N变体完全抑制了cbp60b的自身免疫，而野生型CBP60g不能。进一步研究发现，五重突变体cbp60b;c;d;e;f的自身免疫由经典ETI依赖性和ETI非依赖性通路共同介导。破坏EDS1/PAD4/NDR1仅部分挽救，且CBP60g^D252N与ETI通路缺失联合作用仍无法完全抑制。这些结果表明，CBP60b分支功能缺失引发的自身免疫涉及多重复杂信号机制，为解析植物自身免疫的信号网络提供了新见解。