《Molecular Plant Pathology》：Global Crotonylome Profiling Identifies TaPRXIIB Crotonylation as a Modulator H2O2 Homeostasis in Wheat Resistance to Puccinia triticina
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小麦粮食安全受到叶锈菌（Puccinia triticina）侵染的严重威胁。尽管赖氨酸巴豆酰化（Kcr）在植物胁迫响应中发挥着关键作用，但其在生物胁迫中的功能和调控机制仍大多未知。在本研究中，研究人员调查了小麦在受P. triticina侵染后的Kcr水平，
小麦粮食安全受到叶锈菌（Puccinia triticina）侵染的严重威胁。尽管赖氨酸巴豆酰化（Kcr）在植物胁迫响应中发挥着关键作用，但其在生物胁迫中的功能和调控机制仍大多未知。在本研究中，研究人员调查了小麦在受P. triticina侵染后的Kcr水平，并发现蛋白质巴豆酰化水平的升高增强了小麦对P. triticina的抗性。研究人员首先对小麦响应P. triticina侵染进行了整体巴豆酰化组学分析，在952个蛋白质中鉴定出3333个可定量的Kcr位点。Kcr位点优先侧翼为脂肪族氨基酸，表明该修饰存在序列偏好性。基于巴豆酰化差异表达蛋白（DEPs）的功能富集和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析进一步强调了Kcr修饰的抗氧化酶与胁迫响应过程之间的强关联。此外，研究人员考察了两种抗氧化酶的修饰模式，并确认TaPRXIIB通过调节H2O2稳态负调控小麦对P. triticina的抗性。研究人员发现，TaPRXIIB在K172位的巴豆酰化破坏了H187与其辅基之间的氢键，从而降低了其酶活性。本研究报道了小麦响应P. triticina侵染的整体巴豆酰化组谱，并揭示了TaPRXIIB在K172位的Kcr负调控其酶活性。
**论文解读：小麦抗叶锈病中赖氨酸巴豆酰化修饰（Kcr）调控H?O?稳态的机制研究**
### 一、研究背景、问题与目的
小麦是全球重要的粮食作物，其产量受到叶锈菌（*Puccinia triticina*）侵染的严重威胁，导致产量大幅下降甚至绝收。解析小麦抗叶锈病的分子机制对保障粮食安全至关重要。蛋白质翻译后修饰（PTMs）通过向特定氨基酸残基添加化学基团改变蛋白质的电荷、构象和分子量，从而扩充其功能多样性并实现对环境刺激的快速响应。赖氨酸翻译后修饰（K-PTMs）是其中的重要类型，包括乙酰化、琥珀酰化、巴豆酰化（crotonylation, Kcr）等。近年来，Kcr被发现参与植物能量代谢、碳固定、氨基酸生物合成及信号转导，并在冷害、盐胁迫等非生物胁迫响应中发挥调节作用。然而，Kcr在植物与病原菌互作（生物胁迫）中的作用仍然知之甚少，尤其是其如何调控活性氧（ROS）稳态以影响寄主抗病性尚不明确。活性氧（特别是过氧化氢H?O?）是植物免疫应答中的关键信号分子，其积累与清除的平衡取决于多种抗氧化酶的活性。已有研究表明，抗氧化酶的活性可被PTMs（如亚硝基化、硝化、巴豆酰化）精细调控，从而影响植物对胁迫的耐受性。因此，研究人员提出假设：Kcr可能通过调节抗氧化酶活性来调控小麦对叶锈菌的抗性。本研究旨在通过全局巴豆酰化组学分析，鉴定叶锈菌侵染后小麦中Kcr变化的全局图谱，并探索关键抗氧化酶TaPRXIIB的巴豆酰化修饰如何通过影响H?O?稳态进而调节小麦抗病性。该研究为植物免疫中Kcr的调控功能提供了新视角，并发表于《Molecular Plant Pathology》。
### 二、主要关键技术方法
1. **药理学处理与表型分析**：使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A, TSA）处理小麦叶片以改变整体巴豆酰化水平，随后接种叶锈菌，观察病斑、菌丝扩展及H?O?积累（DAB染色）。
2. **蛋白质组学鉴定**：采用4D无标记定量LC–MS/MS（4D-LFQ LC–MS/MS）技术，在TcLr26小麦叶片与*P. triticina* race 260（非亲和组合）侵染0和24小时进行全局巴豆酰化组分析，并通过平行反应监测（PRM）验证选定修饰位点。
3. **病毒诱导的基因沉默（VIGS）**：利用大麦条纹花叶病毒（BSMV）系统在小麦中沉默*TaPRXIIB*基因，评估其对叶锈菌抗性和H?O?积累的影响。
4. **定点突变与酶活测定**：构建TaPRXIIB K172的巴豆酰化模拟突变（K172Q）和巴豆酰化缺陷突变（K172R），在本氏烟中瞬时表达并纯化蛋白，测定过氧化物酶（POD）活性。
5. **分子对接模拟**：使用AutoDock4进行TaPRXIIB与辅基血红素（heme）在不同修饰状态下的分子对接，计算结合能和抑制常数，预测氢键变化。
### 三、研究结果
#### 2.1 小麦在*P. triticina*侵染期间的赖氨酸巴豆酰化
通过泛抗巴豆酰赖氨酸抗体进行免疫印迹，发现非亲和组合中Kcr在多个时间点广泛分布。用15 μM TSA处理可提高小麦整体Kcr水平，且不影响叶锈菌孢子萌发。在亲和组合（race 165 + TcLr26）中，TSA处理导致叶片夏孢子堆数量减少，吸器母细胞（HMCs）和菌丝扩展面积减小，DAB染色面积（反映H?O?积累）显著增加，同时病程相关基因*TaPR1*、*TaPR2*和*TaPR5*表达上调。这些结果表明，提高蛋白质巴豆酰化水平可增强小麦对叶锈菌的抗性。
#### 2.2 全蛋白质组范围内Kcr位点和蛋白的鉴定与特征
通过4D-LFQ LC–MS/MS，在3038个蛋白中鉴定到10,523个Kcr位点，其中952个蛋白上的3333个位点可定量。多数蛋白（57.8%）含有多个修饰位点，平均每个蛋白含3.46个Kcr位点，高于此前报道。亚细胞定位表明，Kcr蛋白主要分布在叶绿体（42.6%）、细胞质（25.3%）和细胞核（12.2%），其中2.0%位于过氧化物酶体。序列偏好性分析显示，Kcr位点周围富集脂肪族氨基酸（如丙氨酸A、谷氨酸E、赖氨酸K），且修饰位点倾向于位于β-折叠和卷曲区域，且表面可及性低于未修饰赖氨酸，提示Kcr偏好位于蛋白质内部结构。
#### 2.3 巴豆酰化差异表达蛋白（DEPs）的功能富集
将差异修饰蛋白分为四组：仅在24小时有值的组（24HSP）、仅在0小时有值的组（0HSP）、24小时上调组（24HUP）和24小时下调组（24HDN）。KEGG通路富集分析表明，上调修饰蛋白富集于代谢、核糖体、能量代谢、碳水化合物代谢、谷胱甘肽代谢和氧化磷酸化等通路；下调修饰蛋白无显著富集。GO富集分析显示，所有组别在代谢相关过程高度富集，细胞组分主要位于细胞质和核糖体，分子功能与结构组分或活性相关。值得注意的是，上调修饰蛋白参与ROS清除相关通路（如谷胱甘肽代谢、抗坏血酸和醛酸代谢）。
#### 2.4 抗氧化酶巴豆酰化变化参与小麦对*P. triticina*侵染的适应
基于1195个差异修饰蛋白构建PPI网络（置信度>0.7），包含173个节点和5006条相互作用。网络可分为五类：抗氧化酶（14个）、胁迫适应蛋白（33个）、AsA-GSH循环蛋白（15个）、CoQ相关蛋白（8个）和CoA相关蛋白（19个）。抗氧化酶与52个胁迫相关蛋白存在84个直接互作，占直接互作伙伴的51.5%，表明Kcr修饰的抗氧化酶与胁迫响应过程高度关联。PRM验证了8个蛋白（如TaPRXIIB、TaCAT2）在24 hpi修饰水平显著上调。RT-qPCR显示*TaPRXIIB*和*TaCAT2*在亲和组合中表达更高。
#### 2.5 TaPRXIIB和TaCAT2的序列特征与Kcr位点分析
系统发育分析表明，TaPRXIIB与拟南芥AtPRX41/65/67/68、水稻OsPRX1/2等同源，TaCAT2与大麦HvCAT2最相关。TaPRXIIB仅在K172位点于24 hpi巴豆酰化水平升高，该位点位于过氧化物酶结构域且在不同拷贝和同源物种中保守。TaCAT2在七个位点有显著变化，但由于修饰模式复杂，研究后续重点分析TaPRXIIB。
#### 2.6 下调TaPRXIIB通过促进H?O?积累增强小麦抗病性
利用BSMV-VIGS沉默*TaPRXIIB*后，接种叶锈菌，与对照相比，沉默植株叶片夏孢子堆减少，菌丝扩展面积减小，而DAB染色面积显著增加，表明H?O?水平升高。因此，TaPRXIIB负调控小麦抗病性，并通过调节ROS稳态发挥作用。
#### 2.7 K172位点巴豆酰化负调控TaPRXIIB活性
将TaPRXIIB的K172突变为谷氨酰胺（Q，巴豆酰化模拟）或精氨酸（R，巴豆酰化缺陷），在本氏烟中瞬时表达。免疫印迹证实Kcr水平在K172Q中升高，K172R中降低。酶活测定显示，K172Q的POD活性显著低于野生型，K172R活性显著高于野生型，表明K172巴豆酰化抑制TaPRXIIB活性。亚细胞定位无差异。阿尔法折叠预测和分子对接分析表明，野生型和K172R中H187与血红素铁形成氢键，而K172Q突变体中该氢键被破坏。结合能和抑制常数计算显示，K172Q的抑制常数比野生型高约190倍，表明其与血红素结合亲和力弱，酶活性低。因此，巴豆酰化通过破坏H187-血红素氢键降低酶活性。
### 四、讨论与结论
讨论部分指出，本研究中TSA处理提高了整体巴豆酰化水平并增强小麦抗性，首次报道了叶锈菌侵染后小麦的全局巴豆酰化组图谱。与之前关于非生物胁迫的研究不同（如冷害中TaSRT1通过去巴豆酰化负调控耐冷性），本研究发现TaPRXIIB K172的巴豆酰化降低其酶活性，这与枣树ZjPHGPX2的巴豆酰化增强酶活性的效应相反，表明同一类修饰在不同蛋白或不同物种中可产生截然不同的功能结果。这种通过改变特定残基修饰丰度来调节酶活的模式在其他PTMs（如亚硝基化、硝化）中也常见。研究还发现Kcr位点在小麦及其近缘种中保守，且Kcr周围序列偏好酸性氨基酸，可能影响局部结构环境。未来需鉴定负责TaPRXIIB K172修饰的巴豆酰化酶或去巴豆酰化酶，以阐明动态调控网络。
**研究结论**：本研究生成了小麦在叶锈菌侵染期间Kcr的全面数据集，并阐明了Kcr修饰蛋白TaPRXIIB在小麦抗病中的功能。这些发现为Kcr在植物免疫中的调控作用提供了新见解，并可能指导未来抗病小麦育种策略。具体而言，TaPRXIIB K172的巴豆酰化通过破坏Fe-H187氢键降低其过氧化物酶活性从而减少H?O?清除，促进早期ROS积累，增强小麦对叶锈菌的抗性。
