综述：细胞外囊泡：植物-微生物互作中生物活性分子运输的关键介导者

《Molecular Plant Pathology》：Extracellular Vesicles: Key Mediators of Bioactive Molecule Transport in Plant–Microbe Interactions

　　

细胞外囊泡(EVs)是由细胞释放的纳米级脂质双层颗粒，运输多种生物活性货物，如核酸、蛋白质、脂质和代谢物。越来越多的证据表明，细胞外囊泡(EVs)在植物与微生物之间生物分子的双向交换中充当重要介导者，从而在其互作中发挥关键作用。植物来源的细胞外囊泡(EVs)可将防御相关的核酸和蛋白质递送至真菌病原体，抑制其毒力。相反，微生物细胞外囊泡(EVs)将毒力因子（如致病性相关核酸和蛋白质）运输入植物细胞以促进感染。尽管近期有进展，但植物细胞外囊泡(EVs)功能的研究仍显著落后于动物系统。本综述首先总结细胞外囊泡(EVs)通过植物与微生物之间生物活性分子的运输促进跨界通讯的作用，这一过程对植物-微生物互作至关重要。研究人员强调细胞外囊泡(EVs)在建立有益共生中的新兴证据和潜在机制。随后，研究人员探讨细胞外囊泡(EVs)在植物体内免疫信号系统性传播中的假定功能。最后，研究人员基于现有知识提出未来研究方向。通过综合这些见解，本综述为促进植物-微生物互作界面中细胞外囊泡(EVs)的未来功能研究提供了及时且全面的资源。

**1 引言**
细胞外囊泡(EVs)是由细胞分泌的脂质双层包裹的纳米颗粒，内含核酸、蛋白质和脂质等生物活性分子。在动物系统中，细胞外囊泡(EVs)介导供体与受体细胞间功能性生物分子（包括核酸、蛋白质和代谢物）的转移，调控组织发育、免疫调节及癌症发生等过程。尽管植物细胞外囊泡(EVs)早在2009年即从向日葵幼苗中分离，但其在植物-微生物互作中的功能系统性探索始于2017年。植物来源的细胞外囊泡(EVs)可将小RNA(sRNAs)、信使RNA(mRNAs)和蛋白质跨界递送至真菌细胞，抑制真菌毒力和生长；反之，微生物来源的细胞外囊泡(EVs)将小RNA(sRNAs)和效应蛋白等生物活性货物递送至植物细胞，调节宿主免疫。此外，细胞外囊泡(EVs)还能选择性包裹防御响应蛋白，介导植物细胞间免疫信号转导。真核细胞外囊泡(EVs)分为凋亡小体(1000–5000 nm)、微囊泡(100–1000 nm)和外泌体(30–150 nm)三类。由于植物细胞外囊泡(EVs)分离标准涉及0.45或0.22 μm滤膜过滤，本文操作上将植物细胞外囊泡(EVs)定义为外泌体和较小微囊泡的异质混合物。动物细胞可分泌含异质性货物的细胞外囊泡(EVs)，并被特定受体细胞选择性内化。例如，Epstein-Barr病毒(EBV)感染的B细胞释放的细胞外囊泡(EVs)优先包含主要组织相容性复合体II类分子和EBV编码蛋白，可诱导T细胞增殖。癌细胞来源的细胞外囊泡(EVs)促进促肿瘤因子向邻近及远端正常细胞转移，重塑微环境以促进转移。近期密度梯度超速离心分析显示，水稻和拟南芥来源的细胞外囊泡(EVs)分布在高、中、低密度梯度组分，暗示植物也能释放不同亚群。动物中，不同细胞外囊泡(EVs)亚群通过表面分子与受体细胞膜对应分子（如四跨膜蛋白与整合素、凝集素与聚糖、磷脂酰丝氨酸与TIM家族受体蛋白）的相互作用被选择性摄取。植物细胞外囊泡(EVs)也富集四跨膜蛋白、黏附分子、整合素和凝集素，提示存在类似机制。植物细胞能内化微生物来源的细胞外囊泡(EVs)，后者的表面富含病原体相关分子模式(PAMPs)，例如疫霉(Phytophthora sojae)来源的细胞外囊泡(EVs)携带四跨膜蛋白1和3，激活宿主PAMP触发免疫(PTI)。但植物细胞表面PRRs与病原微生物细胞外囊泡(EVs)上PAMPs的特异性识别是否直接介导囊泡内化尚待研究。目前植物系统中仅鉴定出PEN1(Penetration 1)和TET8(TETRASPANIN 8)阳性的细胞外囊泡(EVs)。TET8和PEN1在细胞外囊泡(EVs)中几乎不共定位，密度梯度离心可有效分离，代表两个不同亚群。PEN1阳性细胞外囊泡(EVs)优先被水杨酸(SA)和半活体营养型病原菌丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)诱导，参与SA介导的免疫应答，但其功能贡献尚未明确。TET8阳性细胞外囊泡(EVs)是唯一功能明确的植物细胞外囊泡(EVs)亚型。TET8与哺乳动物外泌体标志物CD63高度同源，与多泡体(MVB)标志蛋白ARA6共定位，提示其通过MVB途径分泌。功能研究表明，TET8阳性细胞外囊泡(EVs)被灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)内化，介导抗真菌小RNA(sRNAs)的跨界转移。TET8缺陷植物中抗真菌小RNA(sRNAs)向灰葡萄孢菌的运输减少，毒力抑制受损，宿主易感性增加。He等人(2021)利用TET8特异性抗体免疫纯化该亚群，发现其选择性富集抗真菌相关小RNA(sRNAs)，并包含多种抗真菌防御基因的信使RNA(mRNAs)。TET8的C端基序与COPI复合体亚基互作，调节糖基磷脂酰肌醇鞘脂(GIPCs)从高尔基体向质膜的转运，从而调控细胞外囊泡(EVs)生物发生和分泌。

**2 植物细胞外囊泡(EVs)在生物活性分子双向递送中的功能**
自2009年从向日葵中首次分离细胞外囊泡(EVs)以来，已从拟南芥、高粱、水稻、甜瓜、半夏、挪威云杉和烟草等植物中分离出细胞外囊泡(EVs)。近期研究表明，植物细胞外囊泡(EVs)介导防御相关小RNA(sRNAs)、信使RNA(mRNAs)和蛋白质从宿主植物向真菌细胞的跨界转移，抑制真菌毒力和生长。小RNA(sRNAs)包括微小RNA(miRNAs)和小干扰RNA(siRNAs)，参与植物生长、发育和胁迫响应。Regente等人(2017)证明向日葵来源的细胞外囊泡(EVs)可被核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)内化，抑制菌丝生长并诱导真菌细胞死亡。Cai等人(2018)从与拟南芥互作的灰葡萄孢菌原生质体中鉴定出42个拟南芥小RNA(sRNAs)，其中31个富集于拟南芥细胞外囊泡(EVs)，表明这些小RNA(sRNAs)可能通过细胞外囊泡(EVs)从拟南芥转移到灰葡萄孢菌细胞。这些细胞外囊泡(EVs)转运的小RNA(sRNAs)靶向并降解灰葡萄孢菌毒力相关信使RNA(mRNAs)，抑制真菌致病性。He等人(2021)在感染灰葡萄孢菌的拟南芥细胞外囊泡(EVs)中鉴定出多种RNA结合蛋白，包括Argonaute 1(AGO1)、RNA解旋酶(RH11、RH37)和膜联蛋白(ANN1、ANN2)。AGO1、RH11和RH37选择性装载小RNA(sRNAs)至细胞外囊泡(EVs)，而ANN1和ANN2介导非选择性装载。缺失这些基因的植物对灰葡萄孢菌毒力基因的抑制减弱，易感性增加。Wang, He等人(2024)进一步揭示，拟南芥在病原菌胁迫下通过细胞外囊泡(EVs)将防御相关信使RNA(mRNAs)递送至灰葡萄孢菌，这些信使RNA(mRNAs)在真菌细胞内翻译成功能蛋白，显著抑制真菌毒力和发育。除核酸外，植物细胞外囊泡(EVs)还富集防御相关蛋白。例如，向日葵细胞外囊泡(EVs)含有多种防御蛋白；拟南芥细胞外囊泡(EVs)中定位了PEN1、PEN3和RIN4。Cai等人(2018)观察到TET8-GFP阳性细胞外囊泡(EVs)与灰葡萄孢菌孢子共孵育后，真菌细胞内出现GFP荧光，表明TET8可通过细胞外囊泡(EVs)从植物转移到真菌细胞。Huang等人(2025)证明水稻通过细胞外囊泡(EVs)将多种抗真菌蛋白（如JLL1、ESP1和DUF26）直接运输至立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)，显著抑制其感染。尽管大量研究证实细胞外囊泡(EVs)介导植物向真菌的跨界生物活性分子递送，但其在植物-细菌直接互作中的作用尚不清楚。Ravet等人(2025)证明植物质外体中的胞外人工小RNA(sRNAs)可跨界进入细菌细胞，靶向毒力相关基因并抑制病原体诱导的气孔重新开放。但Wang, Zhang等人(2024)的研究表明，将植物来源细胞外囊泡(EVs)与细菌病原体丁香假单胞菌番茄致病变种(P. syringae pv. tomato)共孵育30分钟，细菌未能内化这些细胞外囊泡(EVs)，提示细菌病原体可能不直接通过细胞外囊泡(EVs)摄取实现短时间跨界递送。因此，植物小RNA(sRNAs)递送至细菌细胞的精确机制有待进一步研究。

**3 微生物来源细胞外囊泡(EVs)在生物活性分子双向递送中的功能**
植物利用细胞外囊泡(EVs)递送抗病相关核酸和蛋白质至真菌细胞，抑制真菌毒性。在长期互作中，病原微生物是否进化出类似机制，通过细胞外囊泡(EVs)将毒力相关核酸和蛋白质递送至宿主细胞，抑制宿主免疫？成分分析显示，植物病原真菌和细菌来源的细胞外囊泡(EVs)富含感染相关活性分子，包括小干扰RNA(siRNAs)、蛋白质和小分子化合物，提示病原体可能利用细胞外囊泡(EVs)作为武器递送毒力相关活性分子至植物细胞，抑制免疫。He等人(2023)提供直接证据：灰葡萄孢菌来源的细胞外囊泡(EVs)通过网格蛋白介导的内吞作用将多个靶向植物免疫相关基因的小RNA(sRNAs)转入植物细胞，这些小RNA(sRNAs)劫持宿主AGO1蛋白，导致免疫相关基因信使RNA(mRNAs)降解，抑制植物免疫。此外，细胞外囊泡(EVs)也介导真菌毒力蛋白向植物细胞的跨界递送。Wang等人(2025)证明立枯丝核菌(R. solani)通过细胞外囊泡(EVs)将多个效应蛋白（包括NP8和SerP）递送至宿主细胞，其中NP8靶向叶绿体定位蛋白NICP1，抑制叶绿体来源的活性氧(ROS)产生，从而抑制宿主免疫。类似地，植物病原细菌也能通过细胞外囊泡(EVs)递送毒力相关小RNA(sRNAs)和效应蛋白。例如，丁香假单胞菌番茄致病变种(P. syringae pv. tomato)通过细胞外囊泡(EVs)将过氧化氢酶递送至宿主细胞，降解H₂O₂抑制免疫；水稻生香黄单胞菌稻生致病变种(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)通过细胞外囊泡(EVs)递送小RNA(sRNAs)，降解关键基因JMT1的信使RNA(mRNA)，减少茉莉酸甲酯(MeJA)积累，抑制水稻气孔免疫。然而，越来越多的证据表明微生物细胞外囊泡(EVs)也能诱导植物免疫。例如，野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(X. campestris pv. campestris)来源的细胞外囊泡(EVs)通过直接膜融合被宿主细胞内化，触发活性氧(ROS)积累和转录重编程，增强抗病性。荧光假单胞菌(P. fluorescens)和丁香假单胞菌番茄致病变种(P. syringae pv. tomato)的细胞外囊泡(EVs)赋予对拟南芥霜霉菌(Hyaloperonospora arabidopsidis)、致病疫霉(Phytophthora infestans)和丁香假单胞菌番茄致病变种的广谱抗性。高浓度大豆疫霉(P. sojae)细胞外囊泡(EVs)可诱导宿主免疫激活。成分分析表明这些病原体来源的细胞外囊泡(EVs)携带PAMPs，能被植物免疫系统识别。因此，尽管细胞外囊泡(EVs)进化为毒力递送平台促进感染，但植物通过长期共进化已发展出感知细胞外囊泡(EVs)相关免疫信号的能力，从而激活防御应答。此外，有益微生物（真菌和细菌）定殖于植物根际，建立共生关系。早期共生阶段，有益微生物需逃避宿主免疫识别。例如，丛枝菌根(AM)真菌来源的小RNA(sRNA) Rir2216跨界进入宿主细胞，劫持AGO复合体，降解WRKY69转录本抑制宿主免疫，促进共生建立。AM真菌-植物共生界面持续产生的细胞外囊泡(EVs)可能介导这一过程。木霉菌(Trichoderma)通过细胞外囊泡(EVs)递送小RNA Tra-milR1进入宿主细胞，装载至宿主AGO1复合体，靶向降解几丁质酶转录本，抑制宿主免疫，促进共生定殖。共生根瘤菌来源的细胞外囊泡(EVs)诱导根毛变形并激活共生相关基因表达；早期共生中，不透明蛋白MhOpa22通过细胞外囊泡(EVs)递送抑制宿主免疫，在根瘤菌定殖和根瘤形成中起关键作用。有益细菌细胞外囊泡(EVs)还能激活植物免疫。链霉菌(Streptomyces)来源的细胞外囊泡(EVs)激活拟南芥水杨酸(SA)信号通路，增强抗病性。固氮螺菌(Azospirillum) B10的细胞外囊泡(EVs)富含蛋白质、脂质和代谢物，诱导番茄防御相关基因表达和代谢物积累。此外，链霉菌细胞外囊泡(EVs)携带抗生素（如放线菌素、蒽环类、杀假丝菌素和放线紫红素），通过膜融合递送至跨界靶标（如金黄色葡萄球菌和酵母菌），抑制其生长。天蓝色链霉菌(S. lividans)细胞外囊泡(EVs)被植物病原真菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)内化，递送毒力蛋白和抗生素抑制真菌增殖。综上，细胞外囊泡(EVs)在有益微生物向植物病原体或宿主细胞跨界递送生物活性分子中起关键作用，通过直接抑制病原体生长或激活宿主免疫信号通路增强植物防御。

**4 植物细胞外囊泡(EVs)在免疫信号转导中的作用**
动物系统中，细胞外囊泡(EVs)可被邻近细胞摄取或经循环系统长距离运输至远端细胞，介导细胞间通讯。植物细胞外囊泡(EVs)在细胞间通讯中的功能仍知之甚少。植物先天免疫主要包括PTI和效应子触发免疫(ETI)。病原体感染时，植物细胞膜上的模式识别受体(PRRs)（包括受体样激酶(RLKs)和受体样蛋白(RLPs)）识别PAMPs，启动蛋白磷酸化介导的信号级联激活PTI。RLPs缺乏胞内激酶结构域，需与接头蛋白SOBIR1互作激活PTI。近期研究表明，植物细胞外囊泡(EVs)携带多种PRRs（如FLS2、EFR、CERK1、LYK4、LYK5、RLP23）和SOBIR1，提示细胞外囊泡(EVs)可能促进PTI信号的细胞间传递。为对抗PTI，病原体分泌效应蛋白进入宿主细胞抑制免疫。胞内核苷酸结合富亮氨酸重复受体(NLRs)可检测效应子活性并激活ETI。例如，丁香假单胞菌递送效应蛋白HopZ1a，通过酰化假激酶ZED1抑制PTI；植物NLR蛋白ZAR1感知ZED1酰化并触发ETI。植物细胞外囊泡(EVs)含有ZAR1和ZED1，暗示其在介导细胞间ETI信号中可能发挥作用。在病原体感染位点，植物可合成多种长距离信号，通过韧皮部运输至系统组织，激活广谱抗性，即系统性获得抗性(SAR)。已知SAR长距离信号包括壬二酸(AzA)、H₂O₂、N-羟基哌啶酸(NHP)、甘油-3-磷酸(G3P)衍生脂质和脂质转移蛋白DIR1。DIR1的疏水腔可结合G3P衍生脂质并促进其韧皮部运输。此外，某些韧皮部移动蛋白（如硫氧还蛋白h3(TRXh3)）和小RNA(sRNAs)（如tasi-RNAs D7和D8）也参与SAR诱导。近期研究在植物细胞外囊泡(EVs)中鉴定出TRXh3和DIR1。Sanchez-Lopez等人(2024)利用免疫金标记和电子显微镜证明植物细胞外囊泡(EVs)进入韧皮部进行长距离运输，蚜虫侵染增加韧皮部中细胞外囊泡(EVs)分泌。Liu等人(2026)直接证明细胞外囊泡(EVs)通过韧皮部介导小肽USIC（由病原体感染位点产生）的长距离运输，诱导远端组织气孔关闭以建立SAR。这些发现表明感染位点产生的细胞外囊泡(EVs)可能携带多种SAR相关分子（如DIR1、TRXh3、USIC和tasiRNAs D7/D8），并通过韧皮部系统转运至远端组织诱导SAR。Wang, Zhang等人(2024)的研究表明，从拟南芥SAR诱导系统组织中分离的细胞外囊泡(EVs)选择性富集免疫信号蛋白，可上调SAR标志基因并增强受体植物抗病性，表明其在系统组织中放大SAR信号的作用。活性氧(ROS)（包括H₂O₂）是植物免疫的关键信号分子，参与PTI、ETI和SAR。H₂O₂作为SAR的主要长距离移动信号，从局部感染组织经韧皮部转运至远端系统组织。蛋白质组学分析表明，植物细胞外囊泡(EVs)含有H₂O₂产生和扩增机制的关键组分，包括呼吸爆发氧化酶同源物D(RBOHD)、H₂O₂响应性钙通道1(HPCA1)和超氧化物歧化酶(SODs)。RBOHD催化NADPH依赖性超氧阴离子(O₂^?)生成，随后被SODs歧化为H₂O₂。HPCA1是唯一鉴定出的H₂O₂受体，对系统H₂O₂信号传播至关重要。Wang, Zhang等人(2024)的研究表明，局部感染丁香假单胞菌番茄致病变种avrRps4触发野生型拟南芥系统叶中H₂O₂积累并建立SAR，而hpca1功能丧失突变体中这些反应消失，证明HPCA1通过介导系统H₂O₂扩增正向调控SAR。这些发现提出一个模型：植物细胞外囊泡(EVs)通过空间调控H₂O₂生物合成及其系统传播来协调免疫信号。

**5 结论与未来方向**
过去十年中，植物细胞外囊泡(EVs)在植物-微生物互作中的功能研究取得重大进展。当前研究证明，细胞外囊泡(EVs)促进植物与微生物间生物活性分子双向转移，在跨界通讯中发挥关键作用。植物利用细胞外囊泡(EVs)递送抗真菌小RNA(sRNAs)、信使RNA(mRNAs)和蛋白质至真菌细胞，抑制真菌毒力和生长，降低致病性。相反，病原微生物利用细胞外囊泡(EVs)转运毒力因子（包括蛋白质和小RNA(sRNAs)）至植物细胞，抑制宿主免疫以促进感染，尽管这些细胞外囊泡(EVs)中可能存在PAMPs和效应子触发植物免疫。有益微生物可能利用细胞外囊泡(EVs)转移直接抑制病原体生长或激活植物免疫的生物活性化合物。然而，仍存在若干关键挑战：(1) 高纯度植物细胞外囊泡(EVs)亚型的定义和分离。传统方法包括超速离心结合密度梯度离心和尺寸排阻色谱，应用流式细胞术或基于抗体/适配体的免疫亲和分离将有助于阐明亚型功能。(2) 植物细胞外囊泡(EVs)如何穿越致密且刚性的细胞壁到达胞外空间？尽管细胞外囊泡(EVs)含有细胞壁水解酶并因脂质膜流动性发生形态重塑以穿过细胞壁，但精确分子机制尚未完全阐明。(3) 植物细胞如何内化自身分泌的细胞外囊泡(EVs)？动物中，细胞外囊泡(EVs)通过直接膜融合、网格蛋白介导内吞和网格蛋白非依赖内吞途径被摄取，植物是否类似尚待研究。(4)