建立并验证用于检测兽用疫苗中硫柳汞和苯酚的双分析物高效液相色谱方法

《Scientific Reports》：Establishment and validation of a dual-analyte high-performance liquid chromatography method for detecting thimerosal and phenol in veterinary vaccines

　　

摘要

硫柳汞和苯酚等防腐剂对于防止兽用疫苗受到微生物污染至关重要；不过，必须严格控制其浓度，以降低对动物健康的毒性风险，并确保在整个保质期内产品的稳定性。为满足严格的批次放行质量控制和安全要求，精确测定这些防腐剂的含量十分重要。因此，本研究开发了一种双组分高效液相色谱法，用于检测兽用疫苗中的硫柳汞和苯酚，并依据国际兽药注册技术要求协调组织GL2指南对其进行了验证。该方法的色谱分离是在C8柱上进行的，流动相为甲醇与0.1%磷酸缓冲液（pH 7.0）按40:60的体积比混合，其中还含有0.1%的三乙胺，检测波长为245纳米。验证测试包括评估方法的线性、系统适用性、特异性、准确性、精密度、检测限、定量限以及稳健性。结果显示，该方法在硫柳汞浓度为0.01–0.25毫克/毫升、苯酚浓度为0.08–2.00毫克/毫升范围内均具有优异的线性度（R2＞0.995）；同时满足系统适用性标准（保留时间比值在0.90–1.10之间，理论板数大于2,000，尾因子小于2，分离度大于2）；其准确性（回收率在100%±20%范围内）和精密度（相对标准偏差小于5%）也处于良好水平。硫柳汞和苯酚的检测限分别为0.0014毫克/毫升和0.0045毫克/毫升，而检出限则分别为0.0005毫克/毫升和0.0015毫克/毫升。稳健性测试表明，该方法对流动相成分和流速的变化较为敏感。相较于传统的光谱分析法，这种双组分高效液相色谱法为兽用疫苗中防腐剂的定量提供了更为精准可靠的方法，更有利于质量控制，同时也有助于满足国际监管要求。