《Cells》：A Transcriptomic Analysis of Human iPSC-Derived Parathyroid Lineage Cells Reveals Limited Maturation Beyond the Parathyroid–Thymic Primordium
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已有多种方案被报道用于从人多能干细胞体外诱导甲状旁腺分化，但终末分化为成熟甲状旁腺细胞的效率仍然有限。在本研究中，研究人员对甲状旁腺谱系诱导的人诱导多能干细胞（iPS）进行了比较转录组学分析，以阐明其发育阶段身份。与作为成熟甲状旁腺细胞替代参考的成人甲状旁腺腺
已有多种方案被报道用于从人多能干细胞体外诱导甲状旁腺分化，但终末分化为成熟甲状旁腺细胞的效率仍然有限。在本研究中，研究人员对甲状旁腺谱系诱导的人诱导多能干细胞（iPS）进行了比较转录组学分析，以阐明其发育阶段身份。与作为成熟甲状旁腺细胞替代参考的成人甲状旁腺腺瘤及胸腺的比较分析显示，分化细胞表现出与早期甲状旁腺和胸腺发育一致的基因表达模式，包括甲状旁腺-胸腺原基命运决定所需的TBX1。另一方面，成熟甲状旁腺标志基因（如PTH、GCM2和钙敏感受体（CaSR））的表达显著低于甲状旁腺腺瘤。在所检查的分化条件和时长下，应用改良的分化方案并未显著增强成熟甲状旁腺标志物的表达，尽管咽囊发育基因表达得以维持。研究人员的发现表明，当前的体外分化系统可有效诱导甲状旁腺-胸腺原基阶段，但原基向甲状旁腺谱系转变过程中存在发育瓶颈。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
甲状旁腺是调节钙稳态的关键内分泌器官，其功能丧失会导致低钙血症。已有多种方案尝试从人多能干细胞体外诱导甲状旁腺细胞分化，并成功表达甲状旁腺激素（PTH）等标志物。然而，分化细胞的终末成熟度及生理功能（如对细胞外钙的响应性）仍不理想。现有研究多基于标志基因表达或功能实验评估分化效率，但缺乏从发育视角对分化细胞与组织来源甲状旁腺进行全面转录组比较。因此，分化细胞的发育阶段身份尚未明确：它们是否达到成熟甲状旁腺阶段，抑或停留在甲状旁腺-胸腺原基阶段？阐明这一瓶颈对于理解成熟限制机制至关重要。
**研究内容与结论**
本研究对人类诱导多能干细胞（iPSC）来源的甲状旁腺谱系分化细胞、保留成熟特征的甲状旁腺腺瘤（作为成熟甲状旁腺替代参考）及胸腺进行了全面的比较转录组分析。通过层次聚类、基因表达谱及基因集富集分析，研究人员发现分化细胞在转录组上显著区别于成熟甲状旁腺和胸腺，其基因表达模式与早期咽弓/咽囊发育阶段一致，表现为TBX1、HOXA3、EYA1等原基形成相关基因的高表达，但成熟甲状旁腺标志物PTH、GCM2及钙敏感受体（CaSR）的表达远低于腺瘤。此外，免疫荧光显示TBX1蛋白在细胞聚集体中呈异质性、局限性的边缘表达，提示仅部分细胞被定向至甲状旁腺-胸腺原基。进一步比较2D平面与3D球体培养，以及基于文献改良的三种分化方案（Protocol 1–3），均未显著提升成熟标志物表达，尽管咽囊发育基因表达得以维持。这些结果揭示当前体外分化系统可有效诱导至甲状旁腺-胸腺原基阶段，但存在从原基向成熟甲状旁腺谱系转变的发育瓶颈。该研究发表于《Cells》。
**关键技术方法**
研究人员使用以下主要技术方法：
1. 人iPSC（源自外周血单个核细胞，iPSC #5系）在无饲养层条件下培养，通过分步诱导（定形内胚层→前肠前部→咽囊/甲状旁腺谱系）进行甲状旁腺分化。
2. RNA测序（RNA-seq）分析分化第15天细胞的总RNA，并与商业来源的甲状旁腺腺瘤（CR559547，Origene）及胸腺细胞（QS0630，Thermo Fisher）RNA进行比较。
3. 基因集富集分析（GSEA）利用细胞类型特征基因集（C8）评估分化状态。
4. 免疫荧光染色检测TBX1、EYA1及PTH蛋白定位与表达比例。
5. 比较2D平面与3D球体培养，以及三种分化方案（原方案Protocol-1，基于文献改良的Protocol-2和Protocol-3）下基因表达差异。
**研究结果**
**3.1 综合基因表达分析**
通过层次聚类及皮尔逊相关系数分析，研究人员发现分化细胞（4个独立样本）与甲状旁腺腺瘤或胸腺细胞未形成显著聚类，且分化细胞间高度相关（r=0.973–0.982），但与腺瘤（r=0.784–0.818）及胸腺（r=0.763–0.797）相关性较低，表明分化细胞转录组学上独立于成熟甲状旁腺和胸腺。
**3.2 发育相关基因的转录组分析**
分析咽弓阶段特异性基因表达显示，分化细胞高表达早期咽囊/原基形成基因（EYA1、HES1、HOXA3、TBX1），其中RIPPLY3表达高于腺瘤和胸腺；但后期咽囊特化基因（PAX1、PAX9、SIX1）表达降低。成熟甲状旁腺标志物PTH、GCM2及CaSR表达显著低于腺瘤，提示分化局限于早期阶段。
**3.3 TBX1表达**
免疫荧光显示TBX1蛋白定位于细胞聚集体核内，且局限于聚集体边缘区域，阳性细胞比例较低（约15%）。在少数TBX1阳性细胞中可检测到PTH，但多数聚集体无PTH表达，表明TBX1表达异质性，仅部分细胞经历甲状旁腺-胸腺原基分化。
**3.4 培养条件比较**
2D平面与3D球体培养比较：3D培养形成较大球体，延长分化时间后TBX1和PTH表达在两种培养中均上调且水平相当，但HOXA3在2D培养中更高，提示培养模式对早期基因表达有影响但未改变成熟缺陷。
**3.5 分化方案比较**
应用三种分化方案（Protocol-1、2、3）后，所有方案均形成类似细胞聚集体，基因表达谱高度相关（r>0.98）。咽囊发育基因（EYA1、HES1、HOXA3、SIX4）表达在各方案间可比，但Protocol-1中TBX1表达显著高于其他方案，而RIPPLY3无显著差异。GSEA显示Protocol-1富集发育中内皮细胞相关基因集，而改良方案富集肝谱系相关基因集。但所有方案均未增强成熟标志物表达。
**讨论与结论**
讨论部分指出，目前体外分化系统可有效诱导甲状旁腺-胸腺原基阶段，但成熟甲状旁腺细胞标志物（PTH、GCM2、CaSR）表达不足，且改良方案未能克服这一瓶颈。GCM2在甲状旁腺谱系特化中起关键作用，但本研究中的分化方案未能有效上调GCM2，可能限制了向成熟阶段的转化。此外，体外培养缺乏体内微环境（如间充质、神经嵴细胞及信号梯度）的支持，可能加剧成熟障碍。结论部分（翻译原文）：总之，本研究中使用的人iPSC体外分化方案通过激活咽囊发育相关基因诱导了甲状旁腺-胸腺原基分化，但这些方案在高效生成生理性成熟甲状旁腺细胞方面能力有限，从而凸显了从原基向甲状旁腺谱系特化转变过程中存在的发育瓶颈。
