乙二醇改性聚对苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene Terephthalate Glycol-Modified, PETG）作为细胞培养应用中可重复使用且生物相容性基底的研究

《Journal of Functional Biomaterials》：Polyethylene Terephthalate Glycol-Modified (PETG) as a Reusable and Biocompatible Substrate for Cell Culture Applications

　　

开发可重复使用且生物相容的基于生物材料的培养基底，对于改善生物医学研究工作流的可持续性日益重要。在本研究中，研究人员评估了乙二醇改性聚对苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene Terephthalate Glycol-Modified, PETG）作为传统聚苯乙烯（Polystyrene, PS）在体外细胞培养应用中的潜在替代材料。PETG基底通过激光切割制备，并测试了其在多种人类细胞模型（包括颅骨间充质基质细胞（Calvarial Mesenchymal Stromal Cells, CMSCs）、骨髓源性间充质基质细胞（Bone Marrow-derived Mesenchymal Stromal Cells, hBM-MSCs）、真皮成纤维细胞、LHCN-M2成肌细胞和SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞）中支持细胞粘附、活力、增殖和谱系特异性分化的能力。形态学和免疫荧光分析表明，PETG支持细胞附着和粘着斑（Focal Adhesion）形成，与标准PS表面相当。细胞活力和增殖实验证实了随时间推移的代谢活性和生长。此外，组织学染色、肌管形成、神经突生长以及谱系特异性基因表达分析显示，PETG基底支持成骨、成脂、成肌和神经元分化。最后，在经过重复回收、乙醇/紫外线（Ultraviolet, UV）处理和明胶（Gelatin）重包被后，PETG维持了CMSC形态和代谢活性，新基底与重复使用多达三个周期的基底结果相当。这些发现支持PETG作为一种生物相容性培养基底，具有初步的短期重复使用潜力，并可能为实验室工作流带来可持续性效益。

研究背景方面，塑料污染是当前严峻的环境挑战，每年约生产3.6亿吨塑料材料，其中单次使用应用占大部分。生物医学和研究实验室严重依赖一次性耗材以维持无菌和生物安全，产生了大量塑料废物，而现有回收系统难以处理受生物污染的塑料废物。尽管聚乳酸（Polylactic Acid, PLA）、聚己内酯（Polycaprolactone, PCL）等生物基和可生物降解聚酯被研究作为可持续平台，但其灭菌敏感性、降解相关的表面和机械性能变化以及在培养条件下长期稳定性的差异限制了其在常规实验室耗材中的转化。耐用且可回收的热塑性塑料如聚对苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene Terephthalate, PET）及其衍生物乙二醇改性聚对苯二甲酸乙二醇酯（PETG）因其高可回收性、生物惰性、耐化学性和机械耐久性成为潜在替代方案。PETG作为非晶态聚合物，增强了柔性、透明度和抗冲击性，已在血管和骨科假体等生物医学领域应用，但较少关注其作为常规二维细胞培养的平面基底。因此，研究人员旨在评估激光切割的透明PETG片材作为二维细胞培养替代支撑的可行性、生物相容性及短期重复使用潜力。

研究人员开展了激光切割制备PETG基底、表面明胶包被、扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）表征表面形态、多种细胞（CMSCs、hBM-MSCs、真皮成纤维细胞、LHCN-M2、SH-SY5Y）接种培养、形态学观察、洗涤后细胞粘附定量、粘着斑蛋白（Vinculin）免疫化学分析、CellTiter-Glo?发光法测细胞活力、IncuCyte?活细胞分析增殖、分化相关染色（Alizarin Red S、Oil Red O、MHC免疫荧光）及实时荧光定量PCR（quantitative Real-Time PCR, qPCR）基因表达分析，并进行了单次及连续三次的PETG基底回收、乙醇/UV灭菌、重包被后的细胞培养评估，样本来源包括颅缝早闭患者手术废弃颅骨组织分离的CMSCs及商业购买的hBM-MSCs、细胞系等。

研究结果部分，在3.1. Design, Production, and Characteristics of PETG Substrates中，研究人员通过减法制造激光切割从挤出透明PETG板材制备了兼容6孔板的圆盘基底，具光学透明性和适宜培养面积；SEM显示激光切割PETG表面致密无孔，形态与传统PS相当，而熔融沉积建模（Fused Deposition Modeling, FDM）制备的PETG-FDM表面不均且有层纹孔隙，故选用激光切割PETG。在3.2. Biocompatibility Study on PETG中，3.2.1. Morphological Analysis显示多种细胞在PETG上形态与PS相当，呈典型表型；3.2.2. Cell Adhesion Analysis中洗涤实验表明CMSCs在PETG与PS上6、12、24小时粘附率无显著差异，免疫荧光显示Vinculin在PETG上焦粘着斑定位和荧光强度与PS相当，LHCN-M2肌细胞中Vinculin与β-actin共定位及荧光强度亦无差异；3.2.3. Cell Viability Assay中CellTiter-Glo?检测48小时五种细胞在PETG与PS上相对发光单位（Relative Luminescence Units, RLU）相似，无统计学差异；3.2.4. Cell Proliferation on PETG中活细胞分析显示CMSCs在48小时后PS增殖略高，而成纤维细胞和肌母细胞在PETG上增殖显著高于PS，qPCR显示CMSCs的THY1和CCNB1基因表达在两者间无差异。在3.3. Evaluation of Cell Differentiation on PETG中，3.3.1. Osteogenic Differentiation of CMSCs on PETG显示7天成骨诱导后Alizarin Red S染色定量无差异，RUNX2、COL1A1、ALPL基因表达上调且在两材料间无差异；3.3.2. Adipogenic Differentiation of hBM-MSCs on PETG显示10天成脂诱导后Oil Red O染色定量无差异；3.3.3. Myogenic Differentiation of LHCN-M2 Human Myoblasts on PETG显示7天成肌诱导后MHC免疫荧光融合指数无差异，MYOD1、MYOG、MYF6基因表达无差异；3.3.4. Neuronal Differentiation of SH-SY5Y Neuroblastoma Cells on PETG显示10天神经元诱导后神经突生长形态无差异，NEUROD1、MAP2、ID1、TUBB3基因表达无差异。在3.4. Reuse of PETG Substrates中，3.4.1. Morphological Comparison of CMSCs on Reused PETG vs. Single-Use PETG显示单次重复使用PETG与单次使用PETG上CMSCs在6、24、72小时形态无差异；3.4.2. Cell Viability After Repeated PETG Reuse Cycles显示连续三次重复使用（PETG-R3）后48小时CMSCs形态正常，CellTiter-Glo?检测RLU值与全新PETG无显著差异。

讨论部分总结，研究人员指出PETG此前多用于3D打印构建体和器械，本研究聚焦激光切割平面透明片材用于常规二维培养，结合多细胞评估和短期重复使用初步评估。PETG具良好机械回收基础设施，可保留生物相容性和结构完整性，相较PLA等生物塑料具更好灭菌稳定性和机械强度。凝胶包被PETG生物学性能与PS相当，但不同细胞增殖响应不同，可能源于表面形态、润湿性、蛋白吸附和材料刚度等底物线索差异。短期重复使用可行性支持其减少一次性塑料废物的潜力，但需生命周期等定量评估可持续性，未来可研究机械再挤出再造新基底及更高次数重复使用下的表面稳定性、浸出物、内毒素等。结论部分翻译为：本研究强调了PETG作为常规二维细胞培养应用中生物相容且潜在可重复使用基底的潜力。尽管PETG此前已在生物医学和3D打印相关应用中探索，但作为其作为激光切割、光学透明、平面片材基底用于标准细胞培养工作流的研究较少。在此背景下，本研究将PETG视为结合简单激光切割基底形式、多细胞类型生物学评估和初步短期重复使用的实用培养支撑，而非通用生物材料。近期可持续实验室耗材进展引入了PLA基生物塑料等，但存在灭菌稳定性有限、机械脆弱和高成本问题。PETG结合光学透明、耐化学性、耐久性和回收/再加工潜力，是开发可重复使用培养基底的有前景候选。与玻璃盖玻片、PDMS平台等相比，激光切割PETG具轻量、低成本、可定制优势。本研究中PETG支撑多种细胞粘附、增殖和分化，凝胶包被PETG生物学性能与PS相当，兼容多种分子细胞生物学技术。细胞对PETG–明胶界面的响应具细胞类型特异性。PETG短期重复使用可行性支持其减少生物医学研究一次性塑料废物的潜力，但其整体可持续性需生命周期等定量评估，应视为有前景材料而非已证实的可持续替代。未来可研究PETG基底使用后机械再挤出再造，评估再挤出保留生物相容性可行性，整合PETG至循环经济策略。当前主要生物学实验在凝胶包被PETG上进行，未来应比较未包被和不同包被表面，进行接触角、粗糙度、FTIR/XPS、表面电荷、蛋白吸附和刚度等理化分析，更长周期更高次数重复使用评估机械完整性、光学透明性、表面稳定性、浸出物、无菌和内毒素等，以定义PETG可重复使用培养基底的长期稳健性、安全性、可持续性和实用性。论文发表于《Journal of Functional Biomaterials》。