《International Journal of Molecular Sciences》：Therapeutic Window for Intravenous Human Muse Cell Administration in Mouse Spinal Cord Injury
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阶段特异性胚胎抗原-3阳性多能样/巨噬细胞样多谱系分化应激耐受（multilineage-differentiating stress-enduring, Muse）细胞是间充质基质细胞（mesenchymal stromal cells, MSCs）中一个独
阶段特异性胚胎抗原-3阳性多能样/巨噬细胞样多谱系分化应激耐受（multilineage-differentiating stress-enduring, Muse）细胞是间充质基质细胞（mesenchymal stromal cells, MSCs）中一个独特的亚群，占MSCs的1%至百分之几。尽管脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）的干细胞治疗通常靶向亚急性阶段以避免急性期敌对微环境，但Muse细胞的治疗时间窗仍不清楚。研究人员在T9重度挫伤SCI的C57BL/6J小鼠中，于伤后2、8、14或28天（DPI）单次尾静脉注射人骨髓来源（BM）Muse细胞、BM-MSCs（均为5 × 104细胞）或载体，未使用免疫抑制剂。在不同给药时间点中，2-DPI Muse细胞组从注射后14天起的Basso小鼠评分显著高于BM-MSC组和载体组，而其他给药时间点未观察到显著差异。2-DPI Muse细胞组显示向损伤脊髓的归巢显著多于BM-MSC组，在42天时存在持续植入和神经谱系标志物表达。在42天消融植入的Muse细胞部分逆转了运动恢复，表明植入的Muse细胞有助于功能恢复。这些发现提示静脉Muse细胞治疗在SCI后发挥时间依赖性治疗效果，在伤后早期阶段疗效更强。
该研究背景为脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）是一种改变生活的疾病，现有治疗有限，干细胞再生医学虽有前景但尚未建立有效疗法，明确最佳治疗时间窗对最大化疗效至关重要。SCI生物学从炎症主导的急性期演变为胶质瘢痕主导的慢性期，不同阶段的植入挑战不同。传统认为神经祖细胞/干细胞（neural progenitor/stem cells, NPC/NSCs）及间充质基质细胞（mesenchymal stromal cells, MSCs）的最佳治疗窗口为亚急性阶段，以避开急性期敌对炎症环境及后期胶质瘢痕形成，且静脉MSC治疗存在肺滞留问题。多谱系分化应激耐受（multilineage-differentiating stress-enduring, Muse）细胞是具有应力耐受性、非致瘤性内源性巨噬细胞样/多能样干细胞，可通过鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate, S1P）–S1P受体2（S1P receptor 2, S1PR2）轴准确归巢至损伤部位，具有免疫特权，可同种异体给药无需免疫抑制，但其用于SCI的最佳治疗时间窗尚未验证，既往SCI I期临床试验在伤后3周给药是基于传统共识及卒中研究结果，而脑与脊髓在组织结构和再生能力上存在根本差异，可能时间窗不同，且Muse细胞与MSCs特性不同，具备靶向急性期潜力，因此阐明Muse细胞在SCI中的特异性治疗时间窗对临床转化至关重要。研究人员通过开展小鼠重度挫伤SCI模型不同时间点静脉给予人骨髓来源Muse细胞、BM-MSCs及载体的实验，得出伤后2天（2-DPI）给药的Muse细胞组在运动功能恢复、归巢、植入、组织保护等方面均显著优于其他时间点及对照组，而8、14、28 DPI给药无显著疗效的结论，该研究结果明确了Muse细胞用于SCI静脉治疗的有利时间窗为急性期（2-DPI），挑战了传统亚急性窗口共识，为后续临床试验的给药时机设计提供了关键临床前证据，论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。
研究人员为开展研究用到的主要关键技术方法包括：采用雌性C57BL/6J小鼠建立T9重度挫伤SCI模型；通过荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）从人BM-MSCs中分离SSEA-3阳性Muse细胞；设置伤后2、8、14、28天（DPI）四个单剂量给药队列，尾静脉注入5 × 104细胞或载体，无免疫抑制剂；采用Basso小鼠评分（Basso Mouse Scale, BMS）评估后肢运动功能；通过反转相高效液相色谱耦合质谱定量血浆S1P（sphingosine-1-phosphate）；利用Akaluc标记细胞结合IVIS Spectrum计算机断层扫描进行离体生物发光成像评估细胞归巢与生物分布；进行苏木精–伊红（hematoxylin–eosin, HE）、卢克斯坚牢蓝（Luxol fast blue, LFB）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）免疫染色评估组织学；通过抗人线粒体（human mitochondria, hMit）抗体染色及共标神经谱系标志物（神经元核NeuN、腺omatous polyposis coli APC、GFAP）分析细胞植入与分化；量化腰膨大5-羟色胺（5-hydroxytryptamine, 5-HT）阳性区域及突触素（synaptophysin）与胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase, ChAT）阳性运动神经元周体突触；在42天通过白喉毒素（diphtheria toxin, DT）选择性消融人源细胞进行功能缺失验证；采用统计学方法（双因素重复测量方差分析、单因素方差分析、Kruskal–Wallis检验等）分析数据。
研究结果部分如下。
2.1. Plasma S1P Dynamics。研究人员检测SCI后血浆S1P动态变化，发现血浆S1P水平在2-DPI瞬时升高至峰值（3.5 ± 0.35 ng/mg蛋白），较伤前（2.0 ± 0.09 ng/mg蛋白，p = 0.007）显著升高，8-DPI下降至2.2 ± 0.03 ng/mg蛋白（2-DPI vs. 8-DPI, p = 0.011），提示2-DPI为S1P峰值时间。
2.2. In Vivo Dynamics of Injected Cells。研究人员基于2-DPI血浆S1P峰值，用离体生物发光成像比较静脉注入的Akaluc标记人BM Muse细胞与BM-MSCs的早期生物分布，发现Akaluc-Muse细胞分布于损伤脊髓周围，距挫伤中心头尾至少8 mm，病变周围光子通量Muse细胞组高于BM-MSC组（2051.1 ± 167.4 vs. 664.6 ± 198.4 photons/s, p = 0.006），肺信号Muse细胞组显著低于BM-MSC组（672.1 ± 254.4 vs. 2976.4 ± 364.5 photons/s, p = 0.007），骨髓有弱Muse细胞信号，其他器官无明显信号，表明Muse细胞可绕过肺首过效应并优先归巢至损伤脊髓。
2.3. Behavioral Recovery。研究人员通过比较各时间点Muse细胞、BM-MSC、载体组的Basso Mouse Scale（BMS）评分评估运动恢复，发现2-DPI队列中Muse细胞组从伤后14天起BMS评分显著高于BM-MSC和载体组并持续至42天（42天时为5.6 ± 0.3 vs. BM-MSC 3.7 ± 0.4, p = 0.003；vs. 载体 2.8 ± 0.3, p < 0.001），8-DPI队列Muse细胞组虽有一定恢复（4.2 ± 0.6）但与对照组无显著差异（p = 0.128 vs. BM-MSC；p = 0.216 vs. 载体），14及28-DPI队列各组均无明确运动改善，表明仅2-DPI给药的Muse细胞可显著促进运动恢复。
2.4. Histologic Analysis。研究人员在42天通过HE、GFAP、LFB染色评估组织学，发现2-DPI队列Muse细胞组瘢痕样病变面积在中心及头尾0.2 mm处小于载体组（p < 0.001）及BM-MSC组（中心p = 0.002；尾0.2 mm p = 0.030），GFAP定义的胶质瘢痕面积小于BM-MSC（p = 0.007）及载体组（p < 0.001），保留髓鞘面积大于BM-MSC及载体组（各部位p < 0.001）；8-DPI队列三组间瘢痕大小及髓鞘保留无显著差异，表明2-DPI Muse细胞治疗可减少组织损伤并保护髓鞘。
2.5. Marker Expression in the Engrafted Cells。研究人员在42天检测移植人细胞的植入与神经谱系标志物共表达，发现2-DPI队列Muse细胞组在挫伤周围检测到hMit+/4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)+细胞，植入的人源细胞数高于BM-MSC组（16.8 ± 3.0 cells/mm2vs. 1.4 ± 0.4 cells/mm2, p < 0.001），hMit+/DAPI+细胞共表达神经元核（NeuN）+（51.5 ± 6.5%）、adenomatous polyposis coli（APC）+（28.4 ± 4.8%）、GFAP+（5.0 ± 1.0%），表明Muse细胞在急性期植入后可分化为神经谱系细胞。
2.6. Serotonergic Input to the Lumbar Enlargement。研究人员量化腰膨大腹角5-羟色ryptamine（5-HT）阳性区域，发现2-DPI队列Muse细胞组5-HT阳性面积显著大于BM-MSC（p = 0.001）及载体组（p = 0.001），8-DPI队列无差异，表明2-DPI Muse细胞治疗可保留下行5-HT能输入。
2.7. Perisomatic Synapses in the Lumbar Enlargement。研究人员量化腰膨大ChAT阳性运动神经元周围的突触素阳性 puncta，发现2-DPI队列Muse细胞组每个运动神经元突触数显著多于BM-MSC（p = 0.007）及载体组（p = 0.003），8-DPI队列无差异，表明2-DPI Muse细胞治疗可增加腰膨大周体突触密度。
2.8. Loss-of-Function Validation。研究人员在42天用白喉毒素（DT）选择性消融人源Muse细胞，发现Muse细胞组BMS评分较DT前显著下降（p = 0.030），但仍显著高于载体组（p = 0.008），表明植入的Muse细胞部分贡献于运动恢复，剩余益处可能来自早期旁分泌或宿主介导效应。
讨论部分总结：研究人员在讨论中指出本研究通过多时间点比较发现SCI后静脉Muse细胞治疗在急性期（2-DPI）最有效，此时血浆S1P达峰，Muse细胞通过S1P–S1PR2轴归巢优于BM-MSCs，减少肺滞留，早期给药减轻瘢痕、保护髓鞘，植入细胞表达神经谱系标志物，腰膨大5-HT区域及突触密度增加，DT消融部分逆转恢复证实植入细胞的作用。脑与脊髓再生环境不同导致Muse细胞在卒中可作用于亚急性窗而在SCI仅急性期有效，既往SCI I期试验3周给药可能未达最优，未来临床试验应考虑急性期更早给药。讨论亦提及局限性，包括观察期有限、单剂量、无电生理与感觉评估、无束路追踪、无细胞因子谱分析、14及28-DPI队列样本量少、仅用雌性小鼠、部分机制未直接验证S1P–S1PR2轴因果性及异种移植免疫动力学差异等。
研究结论部分翻译：本研究表明伤后早期阶段是小鼠挫伤SCI后静脉Muse细胞治疗的有利治疗时间窗。静脉Muse细胞治疗在2-DPI给药时可带来功能和史学益处，而在8、14及28-DPI给药时与BM-MSC及载体组相比未产生显著的功能或史学改善。血浆S1P水平在2-DPI达峰，离体成像显示Muse细胞向损伤脊髓的归巢更优，病变周围信号更高且肺滞留更低。此外，早期Muse细胞给药减轻了继发性损伤（表现为瘢痕减少和髓鞘保留），并实现稳健植入及神经谱系分化，DT消融分析支持植入Muse细胞的功能贡献。这些结果为未来临床试验的治疗时间窗和给药时机设计提供了关键的临床前证据，支持评估更早的给药方案。这些发现为SCI急性期静脉Muse细胞治疗的进一步研究提供了临床前证据，并强调了Muse细胞与传统干细胞相比的独特生物学特性，提示应根据细胞类型特异性属性优化治疗时机。
