《Gut Microbes》：Human gut flagellome profiling using FlaPro reveals TLR5-related phenotype-specific alterations in IBD
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鞭毛蛋白（flagellin），细菌鞭毛的结构蛋白，激活先天免疫受体Toll样受体5（Toll-like receptor 5, TLR5）。然而，不同鞭毛蛋白结合和刺激TLR5的能力差异很大，表明个体鞭毛蛋白库（flagellin repertoire），即
鞭毛蛋白（flagellin），细菌鞭毛的结构蛋白，激活先天免疫受体Toll样受体5（Toll-like receptor 5, TLR5）。然而，不同鞭毛蛋白结合和刺激TLR5的能力差异很大，表明个体鞭毛蛋白库（flagellin repertoire），即鞭毛组（flagellome）的组成，可能影响宿主-微生物组相互作用和炎症。在此，研究人员开发了FlaPro，一个用于人类肠道鞭毛组（flagellome）定量和功能注释的计算流程。FlaPro中的功能类别来源于一个机器学习模型，该模型基于实验表征的、具有明确TLR5结合和刺激活性的鞭毛蛋白进行训练。将FlaPro应用于一个多组学炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）队列，揭示了在克罗恩病（Crohn's disease）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis）中鞭毛组多样性的显著降低以及沉默鞭毛蛋白（silent flagellins）与刺激性鞭毛蛋白（stimulatory flagellins）比例的下降。这些改变在基因组和转录组层面一致，表明存在一种疾病相关的向更具刺激性的鞭毛组谱的转变。研究人员的研究结果表明，肠道鞭毛组的特定特征有助于TLR5介导的免疫激活，并可能作为功能上可解释的微生物组标志物，用于未来健康和疾病中的微生物组关联研究。该工作流程基于Snakemake实现，可在https://github.com/leylabmpi/FlaPro公开获取。
肠道微生物群在宿主生理中发挥关键作用，其组成或活性失衡（dysbiosis）可导致先天免疫过度激活和慢性炎症。鞭毛蛋白（flagellin）作为细菌鞭毛的结构蛋白，被模式识别受体Toll样受体5（TLR5）识别并启动免疫反应。不同鞭毛蛋白结合和刺激TLR5的能力差异显著，可分类为“刺激性”、“逃逸性”和“沉默”型，但现有方法无法从宏基因组和宏转录组中高通量定量并功能注释这些表型。研究团队开发了FlaPro——一个用于人类肠道鞭毛组（flagellome）定量和功能注释的计算流程，并通过随机森林模型预测TLR5相互作用表型。将该工具应用于一个公开的多组学炎症性肠病（IBD）队列（n=103，含健康对照26例、溃疡性结肠炎28例、克罗恩病50例），发现IBD患者鞭毛组多样性显著降低，沉默/刺激性鞭毛蛋白比例下降，且这些改变在基因组和转录组层面一致。该研究揭示了鞭毛组在TLR5介导的免疫激活中的作用，为未来微生物组关联研究提供了功能可解释的标志物。论文发表在《Gut Microbes》。
**关键技术方法**：研究人员首先从前期研究收集2543个人类肠道鞭毛蛋白序列，并基于92个实验表征的鞭毛蛋白（刺激性与沉默型）提取53个特征（包括序列比对特征、位置特异性特征、TLR5结合残基的物理化学性质、与参考鞭毛蛋白RhFlaB的结构相似性），训练随机森林模型预测TLR5表型。特征工程中使用了MAFFT进行多序列比对、AlphaFold2预测三级结构、Foldseek计算TM-score和RMSD。定量模块采用改良版ShortBRED（替换为DIAMOND2比对器）处理宏基因组（MGX）和宏转录组（MTX）数据，生成122个簇的计数和RPKM归一化丰度。样本队列来自Schirmer等人（2018）的多组学IBD研究。
**研究结果**：
**1. 人类肠道微生物组来源的鞭毛蛋白被预测为刺激性或沉默型：FlaPro注释与模型** 通过10折嵌套交叉验证，模型平均准确率为0.79 ± 0.08，AUC为0.87 ± 0.07，灵敏度和特异度平衡。特征重要性分析显示，与RhFlaB的结构相似性（RMSD）以及与StFliC和RhFlaB C端结构域序列差异是最稳定且排名最高的预测因子。在已知的27个逃逸性鞭毛蛋白中，21个（78%）被归类为沉默型，这符合生物学合理性。模型在决策边界附近出现误判，表明TLR5相互作用可能是一个连续梯度而非二元分类。
**2. 在模拟数据上验证FlaPro** 使用CAMISIM模拟的宏基因组测试显示，FlaPro保留了99.7%的鞭毛蛋白簇及其相对丰度，Spearman相关系数为0.95，证明定量准确性高。
**3. 将肠道鞭毛组与疾病关联：IBD** 在IBD数据集分析中，鞭毛组α多样性（Chao1、Shannon、Observed features）在克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）中均显著降低，且CD更为明显（线性混合效应模型，MTX Chao1 p = 4 × 10
-4）。分层分析显示多样性丧失影响刺激性和沉默鞭毛蛋白，但仅沉默鞭毛蛋白的总丰度在CD和UC中均降低，导致沉默/刺激比例下降。在单个簇水平，差异分析发现6个簇（4个刺激性、2个沉默）在MGX中显著减少，主要来自Butyrivibrio和Agathobacter等共生菌属。MTX分析显示3个簇表达下降，MTX/MGX比率显示2个簇下降，表明存在转录下调。成分感知分析通过最近平衡方法识别出4个与CD相关的标志性簇，但未观察到沉默或刺激类别的富集。整体上，鞭毛组改变更可能反映其相对于所有细菌基因的丰度变化，而非特定鞭毛蛋白比例的重排。
**讨论与结论**：研究人员指出，FlaPro可作为假设生成工具，所观察到的鞭毛组改变可能源于健康相关Lachnospiraceae（含多数已知沉默鞭毛蛋白）的耗竭以及机会性变形菌（含高刺激性鞭毛蛋白）的增殖，同时伴随转录下调。尽管临床和药物混杂因素存在，该初步研究展示了工具区分不同患者类型和对照组的能力。未来需更大规模、均衡临床变量的纵向研究或动物实验验证这些发现。FlaPro的注释策略可扩展至其他模型动物或不同生态位，且可推广至其他与宿主受体相互作用的细菌蛋白家族。局限性包括实验训练集较小、对两种参考鞭毛蛋白的依赖、AlphaFold2结构预测的局限性、以及短读长可能导致的假阳性风险。研究结论翻译：研究人员期待使用FlaPro分析不同免疫相关疾病患者的宏基因组将更深入地揭示肠道微生物组对其发病机制的贡献。未来使用FlaPro对大规模宏基因组和宏转录组数据集进行分析，将有助于定义健康状态下鞭毛组的景观，并发现疾病特异性和共享的改变。
