长双歧杆菌低聚木糖代谢的遗传和酶学基础

《Gut Microbes》：Genetic and enzymatic basis of xylooligosaccharide metabolism by Bifidobacterium longum

　　

双歧杆菌是人类肠道微生物群的常见成员，与宿主健康相关。长双歧杆菌亚种*longum*（*B. longum*）在各年龄段宿主中普遍存在，能够利用多种植物来源的聚糖，包括人体无法消化的低聚木糖（XOS）。研究人员在此表明，XOS利用在*B. longum*成员中具有菌株特异性。在*B. longum* NCIMB 8809中，在XOS上生长诱导了编码三种糖苷水解酶（XouA、XouB和XouC）的基因以及与预测编码ABC型碳水化合物摄取系统的相邻基因（*xouDEF*）的转录。生化分析表明，XouA和XouC是β-木糖苷酶，而XouB是α-阿拉伯呋喃糖苷酶。遗传破坏和互补实验表明，XouA和XouDEF摄取系统是*B. longum*在XOS上生长所必需的。这些发现共同确定了*B. longum*中XOS利用的遗传和酶学基础，并强调了碳水化合物代谢中的菌株水平变异如何为设计靶向益生元和合生元策略以促进肠道健康提供信息。

**研究背景、现存问题与研究动机**

低聚木糖（XOS）是木聚糖的部分水解片段，属于常见于蔬菜和水果中的膳食纤维，人体消化系统缺乏降解木聚糖和XOS所需的碳水化合物活性酶（CAZymes），因此这些聚糖基本完整地到达结肠，被特定肠道微生物利用。双歧杆菌属（*Bifidobacterium*）是人类肠道微生物群的常见成员，其中长双歧杆菌（*Bifidobacterium longum* subsp. *longum*，以下简称*B. longum*）在各年龄段宿主中普遍存在，能够利用多种植物来源的寡糖。已有研究表明，膳食XOS补充可增加双歧杆菌的相对丰度，且*B. longum*菌株的补充可改善与2型糖尿病和肥胖相关的指标。然而，先前研究发现，一些携带XOS活性酶同源物的*B. longum*菌株却无法以XOS为唯一碳源生长，因此XOS利用在*B. longum*菌株中的普遍性及支持该表型的酶促途径仍不清楚。这项研究发表于《Gut Microbes》，旨在通过转录组学、生物信息学、生物化学和遗传学分析，鉴定*B. longum*代谢XOS所需的酶学机器。

**主要关键技术方法**

研究人员使用了多种关键技术方法：1）**转录组分析**（RNA测序）：对*B. longum* NCIMB 8809在XOS、乳糖或木糖上生长的对数期细胞进行RNA提取、rRNA去除和Illumina测序，通过差异表达分析鉴定XOS诱导的基因簇。2）**生化活性测定**：将目标糖苷水解酶基因（*xouA*、*xouB*、*xouC*）克隆至pET28b载体，在大肠杆菌中过表达并纯化His标签蛋白，以合成对硝基苯基（pNP）底物、XOS及阿拉伯木寡糖（AXOS）测定酶活，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC-PAD）分析水解产物。3）**遗传学分析**：通过同源重组构建基因破坏突变株（Δ*xouA*、Δ*xouB*、Δ*xouC*、Δ*xouF*），并使用pBM5质粒进行互补实验，以评估各基因在XOS利用中的必要性。4）**比较基因组学**：对27株*B. longum*菌株（其中25株来自MicrobeMom研究的母子队列，2株为公开基因组）进行BLASTP/BLASTN搜索和基因-性状匹配（GTM）分析，结合全基因组系统发育和基因簇比对。5）**交叉喂养实验**：将*B. longum* NCIMB 8809及其突变株与*Bacteroides ovatus* CCUG 4943在含木聚糖的培养基中共培养，通过选择性平板计数评估生长。

**研究结果**

**XOS利用在*B. longum*菌株间存在差异**：通过测试27株菌在XOS上的生长，发现仅12株能利用XOS，表明该表型具有菌株特异性。

**XOS生长诱导候选摄取和代谢基因簇**：转录组分析鉴定出一个在XOS上显著上调的基因簇（位点标签B8809_1426–B8809_1440），命名为*xyl-xou*簇，包含木糖激酶基因（*xylA*）、木糖异构酶基因（*xylB*）、编码GH120和GH43的糖苷水解酶基因（*xouC*、*xouB*、*xouA*）以及预测编码ABC型碳水化合物摄取系统的基因（*xouDEF*）。

**基因-性状匹配将XOS利用与完整的*xyl-xou*簇联系起来**：对所有27株菌的基因型和表型进行关联分析，发现10株缺失部分簇的菌株均无法利用XOS；5株虽含有同源基因但因转座子插入或点突变导致功能破坏，也无法利用XOS。核心基因组系统发育显示簇的丢失多次独立发生。

**生化分析定义了XOS代谢所需的酶学活性**：纯化的XouA^His和XouC^His对pNP-β-D-吡喃木糖苷具有β-木糖苷酶活性，XouB^His对pNP-α-L-阿拉伯呋喃糖苷具有α-阿拉伯呋喃糖苷酶活性。在XOS底物上，XouA^His表现出显著高于XouC^His的催化效率（K_cat/K_m），且两者均不能水解含阿拉伯糖侧链的XOS。XouB^His能去除α-1,2或α-1,3连接的阿拉伯糖取代基。

**遗传分析证明XouA和XouDEF是XOS利用所必需的**：破坏*xouA*或*xouF*（编码ABC型碳水化合物通透酶）后，菌株无法在XOS上生长，互补实验恢复生长；而破坏*xouB*或*xouC*不影响生长。HPAEC-PAD分析显示，Δ*xouA*突变株培养上清中XOS（含聚合度2–5）未被消耗。Δ*xylA*或Δ*xylB*也阻止XOS利用，但Δ*penD*（木糖摄取系统）不影响XOS利用，表明XOS和木糖经不同ABC型系统转运。

**XouA使*B. longum*能够交叉喂养木聚糖衍生的寡糖**：在与*Ba. ovatus* CCUG 4943共培养于木聚糖培养基时，野生型*B. longum*通过交叉喂养生长，而Δ*xouA*突变株无法生长；互补后恢复。表明*xouA*是交叉喂养所必需。

***xyl-xou*基因簇在多种人类相关双歧杆菌中保守**：通过tBLASTn分析489株双歧杆菌基因组，发现部分或完整的*xyl-xou*簇同源序列存在于*B. longum* subsp. *infantis*、*B. adolescentis*、*B. angulatum*、*B. animalis* subsp. *lactis*、*B. catenulatum*、*B. dentium*和*B. pseudocatenulatum*中，但这些物种中簇的完整性很高，而*B. longum*则呈现出异常的菌株水平变异。

**讨论与结论**

该研究鉴定出介导*B. longum* XOS摄取和代谢的*xyl-xou*位点，并证明XouA是降解短链无分支XOS的主要β-木糖苷酶，ABC型碳水化合物摄取系统XouDEF对XOS利用至关重要。研究结论指出，*B. longum*中XOS利用依赖于一个编码XOS摄取系统和胞内糖苷水解酶的完整*xyl-xou*簇。该簇在同种菌株间变异存在，可能反映了对膳食底物可用性或初级降解者存在的生态适应。这些发现将菌株水平的基因组变异与碳水化合物利用表型联系起来，为理解膳食聚糖如何塑造双歧杆菌生态以及设计更具靶向性的益生元和合生元干预策略提供了框架。具体结论翻译为：总体而言，这项研究定义了*B. longum*中XOS利用的遗传和酶学基础，并表明该能力依赖于一个完整的*xyl-xou*簇，该簇编码XOS摄取系统和胞内糖苷水解酶。通过将菌株水平的基因组变异与碳水化合物利用表型联系起来，这些发现为理解膳食聚糖如何塑造双歧杆菌生态以及设计更具靶向性的益生元和合生元干预策略提供了框架。