印度部落群体肠道微生物组因乳制品与谷物摄入而异

《Gut Microbes》：Gut microbiomes of tribal communities in India vary with dairy and grain consumption

　　

高度多样化的非工业化人群肠道微生物组与非共生祖先状态具有相似性，并与慢性炎性疾病的低发生率相关。然而，目前对全球范围内包括印度部落群体在内的多样化非工业化肠道微生物组的理解仍然有限。在这项研究中，研究人员调查了来自印度四个生物地理区域八个部落群体的76名成人的饮食与粪便微生物组变异，包括西部沿海的Warli，德干高原东北部的Gond和Madia，喜马拉雅东北山麓的Kabui（或Rongmei Naga），以及跨喜马拉雅西北部的Balti、Boto、Brokpa和Purigpa。粪便样本的宏基因组和16S测序鉴定出Segatella、Agathobacter和Faecalibacterium为所有群体肠道微生物组的核心成员，其中Segatella copri（原名Prevotella copri）占主导地位，平均相对丰度为25%–47%。四个跨喜马拉雅群体因饮食独特（以乳制品和多样谷物为主）表现出升高的肠道α多样性和独特的β多样性，其驱动因素为普遍且丰度较高的Bifidobacterium以及与反刍动物微生物组共享的分类单元。存在于乳制品摄入群体中的B. adolescentis菌株在遗传上不同于全球的工业化菌株，并编码与乳制品和谷物摄入选择一致的碳水化合物活性酶（CAZymes）。少数受试者的肠道微生物组在分类和功能特征上与先前描述的加利福尼亚人样本相似，表明全球化带来的压力可能影响部落群体的微生物组。这些结果强调了乳制品牲畜在塑造肠道群落中的营养和微生物学贡献，并强调了生活方式对非工业化肠道微生物组多样性和功能的巨大影响。

该研究背景在于，人类肠道微生物组在健康与疾病中发挥多重作用，全球变异受饮食、抗生素和环境微生物暴露等生活方式因素强烈影响。工业化生活方式与微生物组组成和功能的大幅转变及多样性降低相关，可能驱动免疫失调并促成多种疾病，而饮食改变可对微生物组组成和功能产生健康促进作用。印度拥有数千个族群和巨大饮食多样性，但截至2022年在全球人类微生物组研究样本中占比不足1%，现有数据表明印度成人肠道群落与美国、欧洲、东亚及坦桑尼亚Hadza狩猎采集者均不同，以Segatella copri（原名Prevotella copri）为主导，相对丰度达30%–60%，除少数广泛分类单元外，印度成人核心微生物组随城市化、种族和饮食实践变化，部落群体肠道α多样性通常高于城市居民，常规摄入乳制品的群体Bifidobacterium和Lactobacillus等分类单元水平升高，但迄今仅采样了印度多样化部落群体中一小部分，需进一步评估饮食变异与非工业化肠道微生物组之间的联系。为此，研究人员招募印度四个生物地理区域八个部落群体的76名健康成人，收集饮食数据与粪便样本进行16S和宏基因组测序，这些群体具独特身份、历史、共享文化及传统饮食实践，涵盖西部沿海、德干高原东北部、喜马拉雅东北山麓及跨喜马拉雅西北部不同地理环境与 ancestry 和文化，代表印度地理、祖先和文化多样性，为检验饮食、生活方式与肠道微生物组联系提供独特机会。研究得出跨喜马拉雅群体因每日摄入乳制品（奶、黄油）和小麦、大麦及排除酒精，肠道α多样性升高、β多样性独特，核心微生物组除共有Segatella、Agathobacter、Faecalibacterium外，Bifidobacterium为跨喜马拉雅特有核心属（100%检出率，平均相对丰度11.2%），富集与牛及发酵乳制品相关的分类单元（如Ligilactobacillus、Megasphaera等18个分类单元均与牛或乳相关）；乳制品摄入关联Bifidobacterium高丰度及乳糖、半乳糖代谢功能偏移（L-乳酸脱氢酶基因显著富集，Galactose Metabolic Process由Bifidobacterium和Catenibacterium编码富集于跨喜马拉雅，Leloir途径由Faecalibacterium等编码富集于不摄入乳制品群体，葡萄糖分解转运途径在跨喜马拉雅显著降低）；跨喜马拉雅特有B. adolescentis菌株与全球工业化菌株遗传分化，多维标度（MDS）分析显示印度分离株与尼泊尔过渡群体聚类，与蒙古、Hadza、中欧美菌株分开，系统发育单系性更强，其GH42 β-半乳糖苷酶域受多样化选择，印度菌株特有GH95（岩藻糖苷酶/半乳糖苷酶）和CBM23（甘露聚糖结合域）拷贝数显著高于工业化群体；少数个体（8个高Bacteroides异常值）微生物组分类功能近似加利福尼亚人，提示全球化影响；整体表明乳制品牲畜通过饮食选择塑造肠道群落，生活方式对非工业化微生物组多样性功能影响显著。论文发表于《Gut Microbes》。

作者采用的主要关键技术方法包括：样本来源于印度四个生物地理区域八个部落群体76名18–55岁健康成人（Warli、Gond、Madia、Kabui、Balti、Boto、Brokpa、Purigpa），采集粪便样本；通过16S rRNA基因扩增子测序（V4区，DADA2分析至核糖体序列变体RSVs）和宏基因组测序（平均深度1.46 Gb/样本，metaSPAdes组装，MetaBAT2分箱获得物种代表性基因组SRGs，inStrain定量）；采用多维标度（MDS）分析B. adolescentis菌株单核苷酸变异（SNVs），dbCAN2注释碳水化合物活性酶（CAZymes），HUMAnN 2.0量化功能途径（如L-乳酸脱氢酶、半乳糖降解途径），Maaslin2识别差异丰度分类单元，PERMANOVA检验β多样性关联，主成分分析（PCA）可视化微生物组及CAZyme谱，系统发育分析（RAxML构建GH42氨基酸序列树，BUSTED检验正向选择）。

研究结果如下：

Regional variation in community diets including dairy, grains, and alcohol：通过24小时膳食回顾和季节性食物频率问卷建立平均饮食谱，所有群体每日主食为水稻、姜黄和辣椒，植物性食物为主，每周平均摄入肉类/鱼类两次，除Warli外均每周摄入本土发酵食品；层次聚类显示跨喜马拉雅四群体（Purigpa、Boto、Brokpa、Balti）饮食相似，每日摄入大麦、小麦、奶和自制黄油（其他群体无或罕见），Purigpa定期摄入发酵乳（凝乳/酪乳），其他跨喜马拉雅主要摄入未发酵奶和黄油；Gond、Madia、Kabui和Warli饮用传统发酵酒精饮料（跨喜马拉雅无），Gond和Madia摄入更多绿叶和茎类，Kabui摄入更多鱼，Warli摄入更多水果；乳制品和多样谷物摄入及排除酒精是跨喜马拉雅与其他区域的主要饮食区别。

Elevated gut taxonomic diversity in Trans-Himalayan populations：16S测序检测1005个RSVs（166属），宏基因组获500个SRGs（203属，220个为本研究组装的宏基因组组装基因组MAGs，14个为推定新种）；16S的RSVs数量跨喜马拉雅区域显著高于其他三区域（ANOVA p=0.001，Tukey’s HSD p≤0.05），近饱和稀疏曲线；PCA显示β多样性与区域（16S R2=0.16，p=1×10??；宏基因组R2=0.13，p=1×10??）和群体显著关联，PC2分离跨喜马拉雅与其他区域（海岸、德干高原、东北山麓重叠），跨喜马拉雅内部β多样性关联较弱（16S R2=0.13，p=0.02；宏基因组R2=0.12，p=0.19）；鉴定8个高Bacteroides（含Phocaeicola、Parabacteroides）异常值（16S相对丰度>13%，宏基因组>7%），其α多样性更低（16S p=0.002），Segatella与Bacteroides负相关（16S p=4.2×10??，宏基因组p=0.006），排除异常值后续分析；表明跨喜马拉雅具独特组成及高α多样性，地理隔离非主要驱动。

Core microbiomes feature Segatella and regional diversity：100%非异常值样本核心微生物组（属水平）为Segatella（平均47.0%）、Agathobacter（原名Eubacterium rectale，平均7.1%）、Faecalibacterium（平均4.9%）；宏基因组中9个SRGs为Segatella copri（7个为本研究MAGs），另有Leyella（8个MAGs，平均3.9%）、Hallella（2个MAGs，平均1.4%）、Segatella hominis（1个MAG，平均1.5%）等原Prevotella属分类单元；区域核心微生物组大小10–21属，Catenibacterium、Dialister、Sutterella等为三区域核心，Lachnospira等为两区域核心；Bifidobacterium为跨喜马拉雅特有核心（100%检出，平均11.2%），其他区域67%检出、平均0.3%，关联其每日乳制品和多样谷物摄入。

Trans-Himalayan gut microbiomes are enriched for bacteria associated with cattle and fermented dairy：Maaslin2鉴定58个属在跨喜马拉雅与其他区域差异显著（q≤0.05），42个更高丰度，18个高于所有其他三区域；高富集丰度属包括Bifidobacterium和Ligilactobacillus（原名Lactobacillus，具乳糖发酵能力/响应饮食乳制品），Warli（每周乳制品）二者合计平均1.1%，跨喜马拉雅13.8%，Gond等（不摄入）0.1%；跨喜马拉雅Segatella丰度低于其他区域；18个高富集分类单元均既往关联牛或乳生产（Ligilactobacillus、Megasphaera等在发酵乳中检出，Bifidobacterium等在生乳/发酵乳中发现但种不同于人源，Parolsenella等实验证乳糖发酵，Rikenellaceae_RC9_gut_group等在生乳检出，17/18在牛瘤胃、16/18在反刍动物粪便、13/18在牛生殖系统检出），表明乳制品丰富饮食和生活方式驱动独特组成及高多样性。

Abundant Bifidobacterium associated with functional shifts in gut sugar metabolism：哺乳动物的乳为天然乳糖（葡萄糖+半乳糖）来源，Bifidobacteriales编码“双歧支路（bifid shunt）”产短链脂肪酸（SCFAs）乙酸和乳酸；宏基因组显示每日乳制品群体（跨喜马拉雅）L-乳酸脱氢酶（双歧支路关键酶）显著富集（vs每周Warli p=1.1×10??，vs不摄入Gond等 p=5.9×10??），Bifidobacterium贡献32%基因，其他由Agathobacter、Roseburia等编码；“乳糖和半乳糖降解（Lactose and Galactose Degradation）”途径（Metacyc）跨喜马拉雅高于不摄入群体（p=0.006），由Ligilactobacillus而非Bifidobacterium驱动；半乳糖降解两途径：“Galactose Metabolic Process”由Bifidobacterium和Catenibacterium编码在跨喜马拉雅富集（p≤0.011），Leloir途径由Faecalibacterium、Agathobacter和Lachnospiraceae_bacterium_5_1_57FAA编码在不摄入群体富集（p=2.5×10??）；葡萄糖分解转运途径跨喜马拉雅显著更低（p≤0.014），Faecalibacterium、Agathobacter和Leyella在不摄入/少摄入乳制品群体贡献更大；表明每日乳制品关联Bifidobacterium高丰度将功能从葡萄糖代谢转向特定乳糖半乳糖代谢，饮食碳水化合物对肠道驻留菌株选择所致。

Endemic strains of Bifidobacterium adolescentis encode distinct CAZymes：B. adolescentis为最普遍丰度的Bifidobacterium种（次之B. longum和B. sp002742445），获20个B. adolescentis MAGs（平均90%完整性，1.6%污染），对比全球112个公开基因组+类型株ATCC 15703；104,289个双等位SNVs的MDS分析显示强地理和宿主生活方式结构（印度与尼泊尔聚类，分离蒙古、Hadza、中欧美，印度菌株单系性强于中欧美）；本研究SRG与ATCC 15703基因组98.4%相同（80%长度），~70 kb低比对区邻近4个CAZyme基因，含GH42 β-半乳糖苷酶（裂解β-连接半乳糖如乳糖）；GH42氨基酸系统发育树显示全球B. adolescentis有18个变异（≥1氨基酸差异），两最常见等位占39%和29%分布于多区域；印度SRG的GH42与B. catenulatum仅差1/373氨基酸（0.3%），与ATCC 15703差29个（7.8%）、其他印度菌株平均28个（7.5%），提示双歧杆菌种间水平基因转移；GH42域dN/dS=0.091（净化选择），23/373密码子非同义>同义替换，BUSTED检测表位多样化选择（p=0.0016），10个密码子印度等位在正选择，3个包括309位缬氨酸为印度MAGs分支特有；拷贝数分析显示印度B. adolescentis显著富集GH95（岩藻糖苷酶/半乳糖苷酶，>半数印度MAG有，工业化大多无）和CBM23（甘露聚糖结合域，多数印度MAG 1拷贝，工业化大多无），蒙古富集GH42、CE9（N-乙酰己糖胺磷酸脱乙酰酶）和CBM23；表明人源B. adolescentis的CAZyme含量随地理和宿主群体变异，印度菌株特有乳相关域可能适应宿主饮食（CAZyme增减）。

Gut microbiome CAZymes and substrates vary strongly with lifestyle and diet：CAZymes对肠道碳水化合物竞争至关重要，工业化改变微生物组发酵能力（如Hadza低Bacteroides编码更多植物底物CAZymes，美国高Bacteroides更多黏蛋白底物）；对比本研究印度样本与37名加利福尼亚人（同协议组装定量）的CAZyme谱（dbCAN2注释412家族），PCA显示印度群体（R2=0.16，p=0.003）和区域（R2=0.10，p=0.001）显著变异，跨喜马拉雅独特，加利福尼亚几乎完全分离（R2=0.19，p=1×10??），除高Bacteroides异常值（与加利福尼亚共享高Bacteroides、Phocaeicola、Parabacteroides和低Segatella，但无Alistipes和Blautia_A）；印度群体间CAZyme密度无差异（p=0.76/0.54），加利福尼亚（p=2.3×10??）和印度异常值（p=0.04）显著更高（Bacteroides基因组CAZyme密度60.9基因/Mb > Segatella 45.1，KS p=3.6×10??）；76个CAZyme家族在印度（非异常值）与加利福尼亚差异显著，印度富集降解淀粉（GH13_6、GH13_42）、半纤维素（GH43）、果胶（PL1）的植物多糖CAZymes（10–1000倍），加利福尼亚富集酵母（GH76）、海藻（GH43_31）、动物（GH88）多糖CAZymes；跨喜马拉雅较其他印度群体~1000倍富集GH13和GH43亚科（植物靶向）及~10倍富集GH42（β-半乳糖苷酶），一致其每日大麦、小麦、乳制品和全群体水稻主食；表明种群间CAZyme丰度差异反映分类差异，部分由饮食生活方式塑造。

讨论部分总结：自2007年人类微生物组计划启动，研究表明肠道微生物群在健康中重要作用及与地理生活方式强变异，饮食是可改变的生活方式组分，与肠道微生物组互作塑健康疾病；印度有全球非洲外最大土著人口，部落群体具传统饮食（文化本地食物塑造），但迄今少有参与微生物组研究；本研究分析印度四生物地理区域八部落群体饮食与粪便样本探非工业化肠道微生物组与饮食关系。跨喜马拉雅Boto、Brokpa、Purigpa、Balti与其他区域Gond、Madia、Kabui、Warli在饮食和微生物组有区分：仅跨喜马拉雅每日摄入小麦、大麦、（多非发酵）乳制品且不饮酒，肠道α多样性升高（部分因Bifidobacterium及与牛瘤胃共享低丰度分类单元），提示牛到人细菌转移（经乳产品或接触牧民）驱动多样性升高（类似肯尼亚儿童牲畜喂养关联多样性、农场动物人细菌/耐药基因转移研究），虽缺直接牲畜/乳测序但环境微生物（如牛微生物组）可能贡献独特组成。跨喜马拉雅Bifidobacterium丰度超多数工业化成人但近似埃塞俄比亚牧区饮奶儿童，其为长期肠道驻留菌（非乳制品反复补充的 transient），双歧杆菌碳水代谢基因多30%、快速响应饮食，且天然发酵乳中不高（工业发酵乳添加人源婴儿分离株为益生菌），高丰度更可能是饮食生态选择的长驻菌，半乳糖葡萄糖代谢偏移支持饮食乳糖选择Bifidobacterium。成人乳糖酶（lactase）断奶下调，乳糖耐受（lactase persistence）在部分人群正选择，但现代人类2/3非持久（印度70–100%），小肠无乳糖酶使乳糖达结肠由细菌发酵，双歧杆菌与非持久关联（非持久者多乳制品摄入关联高Bifidobacterium，实验获乳糖耐受），提示双歧杆菌与乳糖非持久者互利关系（适用于跨喜马拉雅，其乳糖持久状态未知），乳制品选择共生Bifidobacterium可能助乳制品成全球营养文化组分。局限：群体间地理与饮食近完美相关（混淆关联），跨喜马拉雅四群体近且饮食似，距其他四群体远且饮食异，因设计采样四农村无先验饮食知识（Boto等四群体谱系文化异但饮食意外似）；每群体样本量适中、元数据有限（表S1）限制统计功效及年龄性别等混杂效应，跨喜马拉雅和Kabui较高BMI（有限数据）可能关联微生物组；功能宏基因组示乳制品和植物（谷物）促跨喜马拉雅独特组成，横断面不能证因果但识别关联待未来实验/其他群体复现。印度部落群体（多非工业化）是理解人肠道微生物组独特欠采样资源，本研究适度宏基因组测序发现14新菌种200本地菌株，提示欠采样群体仍有更多多样性；少数受试者异常高Bacteroides（跨方法验证）提示工业化已开始，既往研究本地微生物组可立即（泰美Hmong/Karen移民美）或数十年（尼泊尔生活方式梯度）中断，未来更多印度群体宏基因组配对标准化饮食生活方式数据是关键深化理解；本研究八传统群体多样饮食提供工业化干扰相对较少的人-微生物关系新见解。

研究结论部分翻译：自2007年人类微生物组计划启动，大量研究表明人类肠道微生物群在健康中发挥重要作用并随地理和生活方式强烈变异。尤其饮食是可改变的生活方式组分，与肠道微生物组互作塑造健康和疾病。印度拥有非洲以外全球最大的土著人口，部落群体践行由文化和本地可用食物塑造的传统饮食。然而，迄今相对少数印度部落群体参与了肠道微生物组研究。在这项研究中，研究人员分析了印度四个生物地理区域八个部落群体的饮食习惯和粪便样本，以探索饮食与非工业化肠道微生物组之间的关系。若干饮食和微生物组特征区分了位于西北跨喜马拉雅的Boto、Brokpa、Purigpa和Balti群体与位于印度其他区域的Gond、Madia、Kabui和Warli群体。只有跨喜马拉雅群体成员报告每日摄入小麦、大麦和（大多非发酵）乳制品，此外从不饮酒。肠道微生物组多样性指标在跨喜马拉雅群体中也升高，部分由显著的Bifidobacterium驱动，但也由与牛瘤胃微生物组共享的低丰度分类单元驱动。这一结果表明，细菌从牛到人的转移（可能通过乳制品或与乳制品牧民接触）可能有助于驱动跨喜马拉雅肠道微生物组升高的多样性。类似的肠道微生物组多样性与牲畜喂养家务的关联此前在肯尼亚村庄儿童中被确定，同时多项研究报道了农场动物与人类之间的抗生素耐药基因和/或细菌转移。尽管本研究缺乏跨喜马拉雅牲畜或乳制品的直接测序，但包括有据可查的牛微生物组在内的环境微生物可能有助于跨喜马拉雅肠道微生物组的独特组成。跨喜马拉雅肠道中观察到的Bifidobacterium流行率和丰度超过大多数工业化人群的成人，但类似于主要以乳为食的埃塞俄比亚牧区儿童的状况。这一结果提出了这些群体中的Bifidobacterium是否是长期肠道驻留菌而非频繁通过乳制品摄入补充的transients的问题。Bifidobacterium被广泛认为是共生肠道分类单元，近期遗传证据显示其与人类共多样化。Bifidobacterium物种在各年龄段人类肠道中几乎无处不在，且在相关性和干预研究中与众多积极健康结果相关。双歧杆菌也比其他肠道细菌多投入30%的基因用于碳水化合物代谢，使其能在多种饮食碳水化合物上生长并快速响应宿主饮食变化。与Lactobacillus和Streptococcus不同，Bifidobacterium在自然发酵乳制品中未发现高丰度。相比之下，最初从人类婴儿粪便中分离的Bifidobacterium菌株通常被添加到工业发酵乳制品中作为益生菌。鉴于此背景，跨喜马拉雅肠道中高丰度的Bifidobacterium更有可能是由饮食生态选择的长期驻留菌，而非适应性差的、通过发酵乳制品反复补充的transients。我们观察到的半乳糖和葡萄糖代谢的功能偏移进一步支持饮食乳糖可能在肠道中选择Bifidobacterium的观点。在哺乳动物和所有史前人类中，乳糖酶在婴儿期小肠中产生，断奶后下调。尽管成年后乳糖酶持久性在一些人群中经历了正选择，但近三分之二的现代人类是乳糖酶非持久的，包括全印度采样的70–100%的人群。小肠中宿主乳糖酶的缺失使饮食乳糖到达结肠，在此由肠道细菌发酵。因此，肠道微生物组与人类基因型之间少数被复制的关联之一是Bifidobacterium与乳糖酶非持久性的关联。在非持久成人中，更多乳制品消费与更高的Bifidobacterium丰度相关，其自身也与实验获得的乳糖耐受相关。此类发现提示Bifidobacterium与消费乳制品的乳糖非持久者之间存在互利关系，这也可能适用于跨喜马拉雅群体（尽管其乳糖酶持久状态未知）。有趣的是，近期研究发现乳糖酶持久性独立于乳制品养殖的传播进化，且与印度和英国的牛奶消费关联甚微。乳制品对共生Bifidobacterium的潜在选择可能甚至帮助建立了乳制品作为全球营养和文化重要组分的基础。本研究的一个重要局限是群体间地理与饮食近乎完美的相关性，这使饮食与微生物组之间的关联部分混淆。具体而言，所有四个跨喜马拉雅群体位置相当接近且饮食相当相似，但与其他四个饮食定性不同的群体距离很远。这一模式是因为我们的研究设计为在无先验社区饮食知识的情况下采样四个农村地点，出乎意料的是Boto、Brokpa、Balti和Purigpa之间的饮食虽谱系和文化不同却相似。其他局限包括每个群体的样本量适中以及参与者元数据的可用性受限（表S1），这限制了统计功效并可能掩盖已知混杂因素（如年龄和性别）对肠道微生物组的影响。例如，从有限数据中观察到的跨喜马拉雅和Kabui群体较高的BMI可能以多种方式与微生物组组成相关。尽管如此，我们展示了功能宏基因组分析，表明乳制品和植物（如谷物）都可能促成跨喜马拉雅肠道微生物组的独特组成。虽然像这样的横断面群体研究不能证明饮食与肠道微生物组之间的因果关系，但它可以识别出值得未来实验探索或在其他群体中复现的有趣关联。印度的部落群体（如许多其他非工业化群体）是理解人类肠道微生物组独特且采样不足的资源。即使本研究中进行的适度深度宏基因组测序也发现了14个新细菌物种和200个本地菌株，表明在采样不足的群体肠道中仍有更多微生物多样性有待发现。尽管如此，我们在几名异常受试者中观察到异常高的Bacteroides丰度（跨DNA提取和测序方法复现），这表明这些群体的工业化路径可能已经开始。既往研究发现，本地肠道微生物组特征几乎可以立即中断（如从泰国移民到美国的Hmong和Karen个体），或在数十年生活方式改变中中断（如生活方式梯度上的尼泊尔群体）。未来，来自更多印度群体的宏基因组测序配对标准化饮食和生活方式数据将是深化我们对印度微生物组进化理解的关键。这项针对八个具有多样饮食的传统群体的研究，为迄今为止似乎相对较少受工业化干扰的人类-微生物关系提供了新的见解。