五味子甲素靶向递送至心脏内皮通过抑制铁死亡减轻心肌缺血再灌注损伤

《International Journal of Nanomedicine》：Targeted Delivery of Schisandrin A to Cardiac Endothelium Alleviates Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury via Suppression of Ferroptosis

　　

**目的** 心肌微血管损伤在心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）中起关键作用，铁死亡（ferroptosis）已成为心脏损伤的重要贡献者。尽管五味子甲素（Sch）具有心脏保护作用，但其临床应用受到稳定性差和生物利用度低的限制。本研究旨在开发一种心脏微血管内皮细胞（CMEC）靶向递送系统用于Sch，并评估其减轻CMECs铁死亡的能力，从而缓解MI/RI。**方法** 将心脏内皮靶向肽CRPPR与DSPE-PEG2000偶联，制备负载Sch的纳米颗粒（CRPPR@Sch）。通过小鼠缺血45分钟后再灌注6小时诱导MI/RI。连续7天静脉注射CRPPR@Sch、游离Sch或非靶向DSP@Sch。体内评估心脏功能、梗死面积、微血管完整性和铁死亡相关标志物。体外，将CMECs暴露于缺氧/复氧（H/R），并评估铁死亡。**结果** CRPPR@Sch有效积聚在心脏内皮细胞中，改善心脏功能，减小梗死面积，恢复微血管灌注，并减轻CMEC损伤。RNA-seq表明CRPPR@Sch抑制了铁死亡相关通路。体内外实验表明，CRPPR@Sch显著上调GPX4表达，降低ROS、脂质过氧化和铁死亡标志物。此外，TRIM25表达在MI/RI小鼠和H/R损伤的CMECs中升高。免疫共沉淀（Co-IP）和分子动力学模拟揭示Sch结合GPX4并干扰TRIM25介导的GPX4泛素化和降解。**结论** CRPPR@Sch有效将Sch递送至心脏内皮，通过破坏TRIM25-GPX4相互作用稳定GPX4，从而抑制CMECs铁死亡，最终保护MI/RI中的心肌微血管损伤。

**论文解读**

**研究背景与问题**
心肌梗死（MI）是全球主要死亡原因，及时恢复冠脉血流（再灌注）是挽救缺血心肌的金标准，但再灌注过程会引发额外的心肌损伤，即心肌缺血再灌注损伤（MI/RI）。MI/RI的病理机制涉及钙超载、氧化应激、炎症和线粒体功能障碍，导致心肌细胞和心脏微血管内皮细胞（CMECs）死亡。CMECs是心脏中数量最多的细胞类型，维持微循环完整性，对缺血/缺氧-复氧损伤尤为敏感，其功能障碍被认为是心肌“无复流”和收缩衰竭的关键因素。然而，针对CMECs保护的策略仍不充分。铁死亡（ferroptosis）是一种铁依赖的非凋亡性调节性细胞死亡，由磷脂过氧化过度引发，其核心调节因子谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）在MI/RI中表达和活性受损。三结构域蛋白25（TRIM25）作为E3泛素连接酶，可通过介导GPX4的K48连接泛素化促进其降解，从而驱动铁死亡，但TRIM25-GPX4轴在MI/RI内皮铁死亡中的作用尚不清楚。五味子甲素（Sch）源自中药五味子，具有心脏保护潜力，但水溶性差、化学不稳定和生物利用度低限制了其临床应用。因此，开发靶向递送系统将Sch递送至受损心脏内皮，并阐明其是否通过调控TRIM25-GPX4轴抑制铁死亡，是本研究需解决的关键问题。

**研究内容与结论**
研究人员开发了基于CRPPR肽偶联DSPE-PEG2000的Sch负载纳米颗粒（CRPPR@Sch），在雄性C57BL/6小鼠MI/RI模型（45分钟缺血/6小时再灌注）和体外CMECs缺氧/复氧（H/R）模型中评估其疗效。结果表明，CRPPR@Sch显著改善心脏功能（左心室射血分数LVEF、左心室短轴缩短率LVFS）、减小梗死面积、恢复微血管灌注、减轻CMECs凋亡和线粒体损伤。RNA-seq揭示CRPPR@Sch抑制铁死亡相关通路。进一步实验证实，CRPPR@Sch上调GPX4表达，降低ROS、脂质过氧化标志物（4-HNE、MDA），增加GSH水平，并抑制铁死亡标志物ptgs2 mRNA。机制上，TRIM25在MI/RI小鼠和H/R损伤的CMECs中表达升高，Co-IP证实TRIM25与GPX4直接结合；分子对接和分子动力学模拟显示Sch与GPX4稳定结合，干扰TRIM25介导的GPX4泛素化和降解。TRIM25敲低增加GPX4水平、改善细胞活力和线粒体功能，而同时敲低GPX4逆转这些保护效应。该研究最终发表在《International Journal of Nanomedicine》，揭示了TRIM25-GPX4轴在MI/RI内皮铁死亡中的关键作用，并为Sch靶向治疗提供了新策略。

**主要技术方法**
（不超过250字）
关键技术方法包括：①靶向纳米颗粒制备：将CRPPR肽与DSPE-PEG2000共价偶联，包裹Sch制备CRPPR@Sch，通过电子显微镜和动态光散射表征形态、粒径和电位。②体内模型：使用雄性C57BL/6小鼠，结扎左前降支（LAD）45分钟再灌注6小时建立MI/RI模型，分为假手术、MI/RI、Sch、非靶向DSP@Sch和CRPPR@Sch组，连续7天尾静脉注射。③体外模型：从3-4周龄小鼠左心室分离CMECs，暴露于缺氧12小时/复氧24小时（H/R）。④功能评估：超声心动图、TTC染色、HE/Masson染色、TUNEL、激光散斑对比分析（LASCA）、明胶-墨水染色、CD31免疫荧光。⑤分子机制：RNA-seq、qRT-PCR、Western blot、免疫共沉淀（Co-IP）、分子对接和分子动力学模拟、siRNA敲低。⑥铁死亡指标：ROS、MDA、GSH、4-HNE、JC-1线粒体膜电位、ptgs2 mRNA检测。

**研究结果**
**1. CRPPR@Sch的制备与表征**
通过电子显微镜显示CRPPR@Sch呈均匀球形，平均粒径约121 nm，电位约-25.32 mV；体内荧光成像显示CRPPR@Sch在心脏中积累显著高于非靶向DSP@Sch，且无毒性（HE染色和IL-1β、IL-6、IL-18水平正常）。

**2. CRPPR@Sch保护心肌免受I/R损伤**
超声心动图显示CRPPR@Sch显著提高LVEF和LVFS；TTC染色显示梗死面积减小；HE和Masson染色显示心肌损伤减轻；TUNEL染色显示凋亡细胞减少。

**3. CRPPR@Sch改善心脏微血管功能**
透射电镜显示CRPPR@Sch改善线粒体形态（萎缩、嵴减少）；LASCA显示恢复血流速度；明胶-墨水染色显示微血管填充缺陷改善；CD31免疫荧光显示CMECs数量增加和形态恢复；NO含量升高。

**4. CRPPR@Sch可能通过抑制铁死亡减轻MI/RI**
RNA-seq主成分分析和差异表达基因聚类后，KEGG通路分析显示铁死亡通路显著富集，热图显示GPX4表达在CRPPR@Sch组升高。

**5. CRPPR@Sch减轻MI/RI诱导的ROS产生和铁死亡**
Western blot和qRT-PCR显示CRPPR@Sch上调GPX4蛋白和mRNA水平；ROS荧光降低；CD31和4-HNE共染显示脂质过氧化减少；MDA降低、GSH升高；ptgs2 mRNA降低。

**6. CRPPR@Sch对H/R暴露的CMECs的治疗效果**
CCK-8和NO检测确定20 μM CRPPR@Sch为最佳浓度；Western blot显示上调GPX4；ROS和4-HNE荧光降低；JC-1显示线粒体膜电位恢复；MDA降低、GSH升高；ptgs2 mRNA降低。

**7. TRIM25敲低抑制H/R诱导的CMECs铁死亡**
qRT-PCR筛选显示TRIM25在MI/RI组中升高最显著；Co-IP证实TRIM25与GPX4相互作用；分子对接得分为-253.01；TRIM25敲低增加GPX4水平、提高细胞活力和NO、降低MDA和ROS，而同时敲低GPX4逆转这些效应。

**8. Sch与GPX4的分子动力学分析**
分子对接显示Sch与GPX4结合（对接分数-6.019 kcal/mol），形成氢键（SER18）；100 ns分子动力学模拟显示复合物稳定（RMSD<2 ?，氢键1-2个，Rg稳定）；Co-IP显示CRPPR@Sch处理后GPX4与TRIM25结合减少。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究首次揭示Sch通过靶向TRIM25-GPX4轴抑制铁死亡，保护MI/RI中的微血管内皮。TRIM25作为E3泛素连接酶，通过K48连接泛素化降解GPX4，促进铁死亡；而Sch通过竞争性结合GPX4，阻止TRIM25介导的降解，从而稳定GPX4，抑制脂质过氧化和铁死亡。该机制不同于传统抗氧化剂，为Sch的临床应用提供了分子基础。研究局限性包括需评估Sch的药代动力学、长期安全性、麻醉并发症及与其他信号通路（如RISK、SAFE）的相互作用。

**研究结论**：CRPPR@Sch有效将Sch递送至心脏内皮，通过破坏TRIM25-GPX4相互作用稳定GPX4，从而抑制CMECs铁死亡，最终保护MI/RI中的心肌微血管损伤。