《International Journal of Biological Macromolecules》：Enhancing 3-hydroxyvalerate concentration in poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) by Pseudomonas aeruginosa strain 78B using volatile fatty acids with papermill effluent blackliquor
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Vinay Kumar|D.H. Lohith Kumar|Bijan Choudhury摘要本研究探讨了利用嗜碱菌株78B以造纸厂废液黑液作为主要水相介质来生产聚羟基烷酸酯（PHAs）的可行性。该菌株对含有34.43%碳元素、pH值为9.0的黑液具有很强的适应能力，无需添加任何
Vinay Kumar|D.H. Lohith Kumar|Bijan Choudhury
摘要
本研究探讨了利用嗜碱菌株78B以造纸厂废液黑液作为主要水相介质来生产聚羟基烷酸酯（PHAs）的可行性。该菌株对含有34.43%碳元素、pH值为9.0的黑液具有很强的适应能力，无需添加任何营养物质即可积累0.35±0.08克/升的聚(3-羟基丁酸-共-3-羟基戊酸)。通过优化酵母提取物浓度至6克/升，PHA产量可提升至3.72±0.34克/升，其中3-羟基丁酸含量为3.08摩尔%。而添加挥发性脂肪酸则能显著提高产量，其中丁酸产生的PHA积累量最高，为8.48±0.70克/升，且主要为聚(3-羟基丁酸)均聚物。丙酸添加后产生的PHA中3-羟基丁酸含量为7.45±0.39克/升，3-羟基戊酸含量为29.09摩尔%，其次是2-甲基丙酸（21.43摩尔%）和戊酸（20.62摩尔%），这表明通过选择合适的前体物质可以精确控制共聚物的组成。通过GC–MS、FTIR、XRD、EDX-SEM以及热分析等手段对产物进行了全面表征，确认确实形成了具有不同结构和热性能的P(3HB)均聚物和P(3HB-co-3-HV)共聚物。与均聚物相比，共聚物中3-羟基戊酸单元的引入降低了结晶度及晶粒尺寸，同时提高了热稳定性，SEM分析也显示了两种聚合物在形态上的差异。本研究为如何有效利用未被充分利用的工业废水流、生产出具有可调控组成和性能的生物塑料提供了可持续的解决方案，这类生物塑料可应用于各种领域，如刚性包装、柔性薄膜以及生物医学材料。
引言
聚羟基烷酸酯（PHAs）是细菌体内的储藏物质，由于其可生物降解、无毒、环保且具备与传统塑料相当的机械性能，因此被视为传统塑料的理想替代品。然而，大规模生产PHAs的高成本仍是当前面临的主要瓶颈[1]。PHA生产中的主要成本因素包括碳源、发酵过程以及后续处理环节。为解决这一问题，需要探索采用来自工业废物的可再生、丰富且成本低廉的碳源作为替代方案[2]。这类方法不仅能减少废物产生，还能为高价值产品的合成提供可能。利用工业废水和副产品进行废物资源化利用，不仅可以大幅降低PHA的生产成本，还有助于推动可持续发展。
印度的制浆造纸行业用水量巨大，每年需消耗约9.058亿立方米的淡水，同时会产生约6.957亿立方米的废水[3]。由于废水中通常含有多种有机成分，因此其净化需要经过复杂且繁琐的处理流程。为应对这些挑战，直接利用废水培养能够积累PHAs的细菌，是一种比传统废水处理方法更经济有效的方案[4]、[5]。利用有机废物让细菌生产聚羟基烷酸酯这一方法备受关注，因为不同菌株在特定培养基和碳源条件下能产生成分各异的PHAs[6]。目前，每年约有1.8亿吨纸浆用于制造纸张，其中近75%是通过硫酸盐法制浆得到的[7]。制浆过程中产生的含溶解木质素的废水被称为黑液，其主要成分是生物质残余物以及煮纸过程中使用的化学物质所产生的无机盐[8]。每生产一吨纸浆就会产生大约七吨黑液，这些黑液可通过加热浓缩后作为燃料，在回收锅炉中产生能量[7]。尽管黑液富含碳元素，非常适合用于生物精炼厂的发展，但直接将其用于PHA合成仍面临诸多生物化学方面的难题。这类废液的碱度很高（pH值大于11），盐分也相当高。此外，其中还存在多种强效的微生物抑制剂，比如来自木质素分解的酚类化合物、呋喃衍生物以及重金属等。这些恶劣条件会抑制大多数常见的非嗜盐工业菌株的生长，同时也限制了微生物对复杂有机成分的代谢能力。
为解决这一问题，研究人员提出了一种策略，即同时向培养体系中加入木屑水解液和挥发性脂肪酸，以此获得不同长度的烷酸酯[9]。此外，研究还表明，通过优化喂养条件以及碳氮比例，能够显著提高利用废黑液生产PHA的效率，例如某些蒙蒂利假单胞菌就能产生以3-羟基丁酸和3-羟基癸酸为两种主要单体的生物聚合物[10]。另外，PHA还能为多种细菌在环境压力条件下存活提供帮助，它们既可以作为能量来源，也可作为细胞内的碳储存物质[11]。对于那些被认定为能够生产环保型PHAs的假单胞菌而言，这一点尤为重要[12]。除了丁酸之外，戊酸也被选作生成3-羟基戊酸单元的前体物质，以此提高3-羟基戊酸在PHA中的占比[13]。此前，Han等人曾研究过短链脂肪酸作为碳源的潜力，他们通过同时添加戊酸和葡萄糖，成功合成了3-羟基丁酸含量在7%到57%之间的PHBHV，这类聚合物还表现出良好的止血性能[14]。不过，目前尚无研究报道过仅使用脂肪酸作为共底物，结合黑液来促进细胞生长和PHA的生物合成。本研究的目的和创新点在于：（1）评估嗜碱假单胞菌株78B利用造纸厂废液黑液作为主要培养基生产PHA的潜力；（2）研究添加酵母提取物对PHA产量及其组成的影响；（3）探究不同挥发性脂肪酸对提高共聚物中3-羟基戊酸含量的作用；（4）分析所生产PHA的物理化学性质，建立结构与性能之间的关系。本研究为利用造纸厂黑液废液作为PHA生产的主要培养基提供了一种新方法，同时还能生产出具有可调控组成和性能的微生物可降解聚合物，满足各种特定应用的需求。
章节要点
菌株的分离与鉴定
嗜碱且耐盐的菌株78B是从印度北方邦萨哈兰普尔的Star造纸厂周边被造纸厂废液污染的土壤中分离得到的。此外，研究人员还收集了造纸厂黑液，并将其作为选择性培养基中的碳源，该培养基的pH值为11.33。黑液中的碳、氢、氮、硫元素含量分析则是在印度鲁尔基印度理工学院化学工程系完成的。
在造纸厂废液黑液中微生物的鉴定与PHAs的生产
能够生产聚羟基烷酸酯的假单胞菌株78B是从印度北方邦萨哈兰普尔的Star造纸厂周边被废液污染的土壤中分离得到的。这些活性菌落经过苏丹黑B染色后，结果显示其中确实积累了PHA（见图S1）。通过16S rRNA测序和系统发育分析，该菌株与嗜碱假单胞菌株AU2418高度相似（见图S1）。此外，还有多种假单胞菌株……
对比分析与未来展望
在本研究中，利用嗜碱假单胞菌株78B成功实现了对造纸厂废液黑液的资源化利用，以生产PHA，当添加丁酸时，PHA的产量可达8.48±0.70克/升，而丙酸则有助于生成富含戊酸结构单元的共聚物。表4展示了本研究结果与其他利用不同类型造纸厂废液的微生物研究之间的对比情况。此前的研究也曾探讨过PHAs的……
结论
本研究成功证明了可以利用富含有机碳（碳含量为34.43%）的造纸厂废液黑液作为主要培养基，让嗜碱假单胞菌株78B生产聚羟基烷酸酯。在没有添加任何营养物质的情况下，该菌株就能利用废液中的有机物质，积累0.35±0.08克/升的PHA，这体现了它利用废液中易得有机化合物的能力。而添加6克/升的酵母提取物后……
CRediT作者贡献说明
Vinay Kumar：文献撰写与编辑、初始草稿撰写、方法设计、实验研究、数据整理、概念构建。D.H. Lohith Kumar：文献撰写与编辑、初始草稿撰写、方法设计、实验研究、概念构建。Bijan Choudhury：项目指导、资源协调、方法设计、概念构建。
利益冲突声明
所有作者均不存在可能影响本文发表的任何利益冲突。
致谢
本研究得到了印度政府科学工程研究委员会（SERB）在国家博士后计划（N-PDF）项目下的资助，该项目名为“利用含盐工业废物作为碳源，通过高细胞密度发酵生产聚3羟基烷酸酯，并借助非卤代溶剂提高产物回收率”，项目编号为PDF/2018/001508。
