靶向与显像产β-内酰胺酶病原体的含氟硼酸酯

《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Fluoro-boronates for targeting and imaging β-lactamase-producing pathogens

　　

双环硼酸酯正被开发为同时靶向金属-β-内酰胺酶（MBLs）和丝氨酸-β-内酰胺酶（SBLs）的抑制剂，以应对日益严峻的碳青霉烯耐药临床挑战。然而，目前对于其在体内环境中的作用方式，尤其是选择性与分布特征，认识仍较为有限。本文描述了一套用于发现含氟双环硼酸酯（F-boronates）的合成与检测体系，这类化合物既可靶向具有临床相关性的MBLs/SBLs，又可实现实时正电子发射断层显像（PET）。研究人员鉴定出¹⁹F-硼酸酯，其可作为对MBLs/SBLs具有强效双重抑制活性的化合物，或作为选择性MBL抑制剂；同时制备了3种结构彼此不同、适用于小鼠PET显像的¹⁸F-硼酸酯。PET显像结果显示，3种¹⁸F-硼酸酯具有相似的分布模式，表现为在膀胱中的显著蓄积以及在脑中的一定分布。值得注意的是，其中一个探针（¹⁸FB2-9）能够有效检测由产MBL和产SBL病原体引起的小鼠感染灶，而¹⁸FB4-2则可选择性显像产MBL病原体。此外，¹⁹F-硼酸酯在小鼠感染模型中表现出显著恢复美罗培南疗效的潜力。这些结果对于硼酸酯类β-内酰胺酶抑制剂及抗生素发现研究具有重要意义，尤其与尿路感染的治疗相关。

该论文发表于《Acta Pharmaceutica Sinica B》，围绕硼酸酯类β-内酰胺酶抑制剂的体内行为、感染显像与抗感染增效作用展开系统研究。研究背景在于，β-内酰胺类抗生素仍是临床治疗的重要基础，但由β-内酰胺酶介导的耐药，尤其是碳青霉烯耐药，已严重削弱其疗效。当前临床可用的丝氨酸-β-内酰胺酶（serine-β-lactamases, SBLs）抑制剂对金属-β-内酰胺酶（metallo-β-lactamases, MBLs）通常无效，而兼具广谱性的双环硼酸酯虽显示出同时抑制MBLs与SBLs的潜力，但其体内分布、组织定位、选择性以及潜在脱靶风险尚缺乏直接证据。由于硼元素具有Lewis酸性，并可能与生物体内顺式二醇发生可逆共价相互作用，因此有必要从体内药代动力学和显像层面系统评估其行为特征。基于此，研究人员设计并合成了一系列含氟双环硼酸酯，借助¹⁸F标记建立PET显像策略，同时评估其作为β-内酰胺酶抑制剂和抗生素增效剂的应用潜力。

研究人员首先基于已报道的硼酸酯抑制剂结构特征及MBL/SBL催化β-内酰胺水解机制，设计了4个系列的含氟双环硼酸酯，即6,6-并环的FB1、FB2系列以及6,5-并环的FB3、FB4系列。这些化合物通过引入羧酸锚定基和含氟取代基，模拟β-内酰胺抗生素与酶活性位点的相互作用。其中FB2系列旨在获得兼具MBL/SBL抑制与显像潜力的骨架，FB4系列则倾向于获得MBL选择性。随后，研究人员通过酶抑制实验、共结晶结构解析、临床分离菌株药敏实验、体内药代研究以及小动物PET-CT成像，系统评价这些化合物的体外与体内性质。最终，研究显示FB2系列中若干化合物具有广谱而强效的双重抑制活性，FB4系列代表化合物则表现出显著的MBL选择性；3种¹⁸F-硼酸酯在小鼠体内均呈现快速肾排泄并蓄积于膀胱的共同分布特征；其中¹⁸FB2-9可用于体内显像产MBL/SBL病原体，¹⁸FB4-2可选择性显像产MBL病原体；若干¹⁹F-硼酸酯还能显著增强美罗培南在多种感染模型中的疗效，尤其在尿路感染模型中效果突出。该研究的重要意义在于，既为硼酸酯类β-内酰胺酶抑制剂的体内行为提供了直接证据，也提出了基于β-内酰胺酶靶向的感染分子显像新策略，并为尿路感染等适应证中硼酸酯药物的开发提供了依据。

主要技术方法方面，研究人员采用有机合成与放射化学标记方法构建¹⁹F-和¹⁸F-双环硼酸酯；采用重组蛋白表达纯化、酶抑制活性测定和底物竞争实验评价其对临床相关MBLs/SBLs的抑制谱；通过X射线晶体学解析抑制剂-酶复合物结构；使用临床分离的Klebsiella pneumoniae、Escherichia coli和Acinetobacter baumannii开展MIC与棋盘稀释协同实验；在SD大鼠中开展药代动力学与组织暴露分析；在健康小鼠及感染小鼠中进行PET-CT动态显像、离体生物分布研究，并在脓毒症、尿路感染和肺炎模型中评估与美罗培南联用的体内疗效。样本来源包括四川大学华西医院临床分离菌株及啮齿类动物模型。

在研究结果部分，论文按照以下几个小标题展开。

2.1. Developing ¹⁹F-boronates as MBL/SBL inhibitors suited for PET imaging studies
本节通过理性设计构建了4个系列共22个¹⁹F-硼酸酯，并对其针对多种临床相关MBLs和SBLs的抑制活性进行了系统评估。结果表明，不同系列具有明显差异化的酶谱特征。FB1系列表现为一定程度的MBL/SBL双重抑制；FB2系列显示出最强、最广谱的活性，其中¹⁹FB2-3、¹⁹FB2-9和¹⁹FB2-10对多种酶达到纳摩尔水平抑制；FB3系列主要偏向SBL抑制；FB4系列则对B1亚类MBLs表现出显著活性而对SBLs作用较弱。该结果说明，含氟双环硼酸酯可通过骨架与侧链调控实现双重抑制或选择性MBL抑制，并具备向PET探针转化的基础。

2.2. Structural basis of ¹⁹F-boronates inhibiting MBL and SBL enzymes
本节利用VIM-2和OXA-48与代表性化合物的共结晶结构，阐明了抑制作用的结构基础。VIM-2:¹⁹FB2-9复合物显示，化合物形成sp³杂化硼酸酯并与活性位点Zn²⁺配位，其羧酸基与Arg228、Asn233形成关键相互作用，结合方式模拟了β-内酰胺水解产物。OXA-48:¹⁹FB2-9复合物则显示其与Ser70形成共价键，并通过羟基与羧酸基建立稳定氢键和静电作用，同样模拟了水解后亚胺培南的结合状态。其他FB2化合物复合物提示此类骨架在MBL/SBL中的结合模式高度保守。FB3系列与OXA-48的结构说明其C3-羧酸基更适合SBL活性位点，从而解释其SBL选择性。该部分证明了双环硼酸酯通过模拟四面体高能中间体或产物状态实现抑制。

2.3. ¹⁹F-boronates restore carbapenem susceptibility in vitro
本节研究临床分离耐药菌中含氟双环硼酸酯对美罗培南活性的恢复作用。尽管这些化合物单药在10 μmol/L时不显示直接抗菌活性，但部分化合物可显著降低美罗培南最小抑菌浓度（MIC）。其中FB2系列，尤其¹⁹FB2-9和¹⁹FB2-10，对表达IMP-1、KPC-2或NDM-1的菌株具有显著增敏作用，多数情况下可将美罗培南MIC降至CLSI断点以下；对表达OXA-48的Acinetobacter baumannii也可产生4–32倍增效。棋盘实验进一步表明这些化合物与美罗培南之间存在强协同作用。结果说明，FB2系列不仅具有酶学活性，也具有细胞水平逆转耐药的潜力。

2.4. In vivo pharmacokinetics of ¹⁹F-boronates
本节通过SD大鼠静脉给药评价选定化合物的初步药代性质。所有受试化合物均在给药后5 min内达到血浆峰浓度，提示其快速进入循环。¹⁹FB2-9具有较高血浆暴露量、较低分布容积和较低清除率，提示其组织穿透有限而系统暴露较好；¹⁹FB2-10与¹⁹FB4-2表现出相近药代学特征；¹⁹FB1-1则表现为暴露较差和清除较快。该部分为后续显像和体内疗效评价提供了候选化合物筛选依据。

2.5. In vivo distribution of structurally different ¹⁸F-boronates
本节完成了¹⁸FB1-1、¹⁸FB2-9和¹⁸FB4-2的放射性合成，并通过PET-CT和离体生物分布研究考察其体内分布。三种探针均显示共同的分布模式，即注射后迅速经肾脏排泄并在膀胱显著蓄积，同时在脑组织中存在中等程度信号，提示其能够跨越血脑屏障。离体分布及对应¹⁹F化合物在尿液和脑组织中的定量检测支持上述结果。另一个重要观察是骨组织和骨髓中的逐渐放射性蓄积，特别是¹⁸FB4-2在早期即出现明显骨髓摄取，提示体内可能发生脱氟。总体上，本节明确了含氟双环硼酸酯的共同体内归趋特征，尤其支持其在尿路系统中的应用前景。

2.6. ¹⁸FB2-9 visualizes MBL/SBL-producing pathogens in vivo
本节评估双重抑制剂探针¹⁸FB2-9对产β-内酰胺酶病原体的体内显像能力。在腹腔感染模型中，感染小鼠相较健康小鼠表现出更强且持续时间更长的全身信号，提示探针可在感染背景下富集。进一步建立小鼠大腿局部感染模型后发现，无论是高剂量还是低剂量的KPC-2编码K. pneumoniae或NDM-1编码K. pneumoniae感染，¹⁸FB2-9均能在感染侧肢体形成显著高于对侧未感染肢体的信号，并可在注射后30 min即实现检测。阴性对照实验中，不表达β-内酰胺酶的K. pneumoniae未产生明显信号，说明该探针的体内追踪依赖于与β-内酰胺酶的相互作用，从而具有较高选择性。

2.7. ¹⁸FB4-2 selectively images MBL pathogens in vivo
本节针对MBL选择性探针¹⁸FB4-2进行体内验证。研究人员在同一只小鼠左右后腿分别接种NDM-1产生菌和KPC-2产生菌，随后进行PET-CT显像。结果显示，探针在NDM-1感染侧产生明显信号，而在KPC-2感染侧几乎无显著信号，且峰值出现在给药后1.5 h。该结果与其酶学选择性和细胞学结果一致，证明¹⁸FB4-2可选择性识别产MBL病原体，具有区分不同β-内酰胺酶耐药机制的应用价值。

2.8. ¹⁹F-boronates potentiate meropenem activity against β-lactamase pathogens in vivo
本节在多个小鼠感染模型中评估¹⁹FB2-9和¹⁹FB2-10对美罗培南疗效的恢复作用。在KPC-2阳性K. pneumoniae脓毒症模型中，两种化合物与美罗培南联用均显著提高生存率，并降低心、肝、脾、肺、肾中的细菌负荷。基于PET所见膀胱富集特征，研究人员进一步在免疫抑制尿路感染模型中验证疗效，结果显示¹⁹FB2-9联合美罗培南可显著降低膀胱和肾脏中的菌负荷，部分动物达到完全清除，且对KPC-2和NDM-1阳性菌株均有效。在肺炎模型中，联合治疗也可降低肺部细菌负荷。该部分表明，这些含氟双环硼酸酯尤其适合作为美罗培南增效剂应用于尿路感染场景。

讨论部分指出，硼酸酯因其独特的Lewis酸性而成为极具前景的药物化学骨架，但安全性和分布问题一直是其开发中的关键顾虑。本文首次将PET用于硼酸酯体内行为研究，证明不同结构的¹⁸F-硼酸酯在体内具有共同的快速肾排泄和膀胱蓄积特征，这一特征与其极性、高水溶性及可能与内源性分子发生可逆共价相互作用有关。该分布模式提示硼酸酯类药物在尿路感染治疗中具有天然优势，同时脑内一定程度分布也提示其具有跨血脑屏障潜力，但这同样需要从毒理学角度加以重视。就感染诊断而言，本研究提出以β-内酰胺酶为靶点的体内显像策略，相较于¹⁸F-FDG具有更高细菌特异性。¹⁸FB2-9适于广谱检测产MBL/SBL病原体，¹⁸FB4-2则有望实现MBL病原体特异识别，两者联合有助于更精准的耐药机制判别与临床管理。就治疗应用而言，研究提示未来硼酸酯类β-内酰胺酶抑制剂开发需综合平衡靶点结合、细菌膜通透性与体内分布，尤其在尿路感染中，提高肾排泄可能是增强疗效并减少副作用的可行方向。论文同时指出，¹⁸F标记硼酸酯存在潜在脱氟问题，后续有必要发展更稳定的标记策略以提高成像准确性。

研究结论部分可译为：
硼酸酯凭借其独特的Lewis酸性，是药物发现中极具前景的一类化合物。鉴于与硼酸酯相关的安全性和分布顾虑，本文首次采用PET显像研究其体内行为。结果揭示，3种结构不同的¹⁸F-硼酸酯在小鼠体内具有共同的药代特征，包括快速经肾排泄进入膀胱。膀胱中的蓄积支持包括β-内酰胺酶抑制剂在内的硼酸酯类药物用于膀胱相关疾病如尿路感染的治疗潜力。其在脑中的明显分布和较长滞留时间则提示硼酸酯具有跨越血脑屏障的可能性，也提醒需要关注脑部暴露的毒理学意义。从感染性疾病诊断角度看，本研究提出了通过靶向β-内酰胺酶实现体内感染灶显像的新策略。广谱MBL/SBL抑制剂¹⁸FB2-9显示出对细菌感染成像的应用前景，而选择性MBL抑制剂¹⁸FB4-2则有助于特异性检测产MBL病原体。二者联合有望实现对MBL与SBL病原体的检测和区分，从而支持更精准的β-内酰胺耐药临床管理。从治疗角度看，¹⁹F-硼酸酯，尤其是¹⁹FB2-9，在多个小鼠感染模型中表现出恢复美罗培南疗效的明确潜力，在尿路感染中尤为突出，并与其独特分布特征密切相关。整体而言，该研究强调了PET在抗生素分布和感染体内成像中的应用价值，并将促进硼酸酯作为治疗药物的进一步发展。