水合微RNA调控纳米平台用于协同润滑和抗炎以缓解骨关节炎

《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Hydrated microRNA-regulating nanoplatform for synergistic lubrication and anti-inflammation to alleviate osteoarthritis

　　

骨关节炎（OA）仍然是一个重大的临床挑战，缺乏有效的疾病修饰疗法。OA的病理进展由涉及软骨磨损和巨噬细胞介导的滑膜炎的恶性循环推动，需要一种同时提供润滑和抗炎作用的治疗。在此，研究人员提出了一种新型的水合纳米递送系统，负载miRNA-let-7c质粒（HydroMiR），提供双重作用策略。HydroMiR在关节腔内表现出延长的滞留和增强的水性润滑，保持滑液的粘弹性并恢复润滑和减震。随后，它根据巨噬细胞外和细胞内微环境进行程序化解锁和电荷反转，从而通过巨噬细胞特异性的主动和被动内吞、细胞摄取和溶酶体逃逸实现精确有效的miRNA调节。通过HydroMiR显著放大的miR-let-7c表达确保巨噬细胞持续有力地复极化为抗炎M2表型，有效控制细胞因子分泌并间接促进软骨细胞迁移、增殖、分化和软骨基质合成。关节内注射HydroMiR显著减轻手术诱导的滑膜炎症、软骨退变和软骨下骨硬化。这种双功能和自组装基因递送纳米平台打破了OA恶性循环，通过持续的水合、润滑和抗炎为OA提供长期治疗益处。

骨关节炎（osteoarthritis, OA）是一种常见的慢性关节疾病，以软骨丢失、软骨下骨结构改变和滑膜炎症平行进展为特征，全球影响超过5亿人口，但缺乏有效的疾病修饰疗法。传统观点强调异常机械应力是OA进展的主要驱动因素，但越来越多的证据揭示了一个涉及软骨磨损和巨噬细胞介导滑膜炎的有害反馈环路：活化的滑膜巨噬细胞分泌促炎细胞因子加剧软骨破坏，而软骨碎片进一步刺激滑膜炎症，形成恶性循环。这一病理机制要求治疗策略同时提供润滑以减轻机械磨损和调节炎症微环境。透明质酸（hyaluronic acid, HA）通过水结合特性形成水合粘弹性网络，提供润滑和减震，但在滑膜炎中，促炎细胞因子诱导内源性HA降解，损害滑液功能。尽管抗炎药物和生物活性剂被广泛探索，但在滑膜中维持M1和M2巨噬细胞之间的持久平衡仍很困难。基因疗法通过质粒DNA编码的miR-let-7c（miR-let-7c pDNA）可促进M2极化，但滑膜巨噬细胞的特异性模式识别受体和溶酶体降解阻碍了持续精准的基因调控。为克服这些局限性，研究人员开发了HydroMiR，一种携带miR-let-7c pDNA的水合纳米递送平台，旨在提供双重治疗功能。该论文发表在《Acta Pharmaceutica Sinica B》上，通过体内外实验验证了其在OA治疗中的协同润滑和抗炎效果。

研究人员为开展研究主要采用了以下几个关键技术方法：合成并表征了PEI-FPBA（3-氟-4-羧基苯硼酸接枝聚乙烯亚胺）和TRPH（Tuftsin-R8-PEG-HA）壳层材料，通过静电组装形成核壳结构纳米复合物（HydroMiR）；利用动态光散射（DLS）和透射电镜（TEM）表征粒径、电位和形貌；采用通用材料测试仪（UMT-3）评估摩擦系数（COF）；通过荧光显微镜和流式细胞术检测巨噬细胞对纳米颗粒的摄取和转染效率；建立THP-1细胞来源的M0/M1巨噬细胞模型，流式细胞术分析CD68、CD86和CD206表型；采用Western blot检测IL1B、IL10、COL II、TGFBR2等蛋白；通过EdU增殖实验、Annexin V-FITC/PI凋亡检测和划痕实验评估软骨细胞功能；构建大鼠前交叉韧带切断加内侧半月板失稳（ACLT+DMM）OA模型，进行关节内注射，并通过微计算机断层扫描（micro-CT）、组织学染色（H&E、番红O-固绿）和免疫组化（NOS2、CD206）评估治疗效果；样本来源包括华西医院膝关节炎患者（Kellgren–Lawrence 3–4级）的软骨和北京HFK公司提供的Sprague–Dawley大鼠。此外，进行了RNA测序分析巨噬细胞转录组变化。

**3.1 合成PEI-FPBA和TRPH**：通过1H NMR和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）确认PEI-FPBA和TRPH成功合成。PEI-FPBA显示苯环特征峰（7.0–7.8 ppm）和B–O吸收峰（1344 cm^-1）；TRPH中马来酰亚胺烯烃质子消失，表明与多肽偶联完全。

**3.2 表征和体外细胞毒性**：组装后的HydroMiR水合粒径约203.8 nm，电位–29.0 mV，呈球形（TEM）。储存7天粒径稳定，Zeta电位保持负值。琼脂糖凝胶阻滞实验表明PEI-FPBA在质粒比≥0.5:1时完全结合pDNA。MTT实验显示PEI-FPBA和TRPH对M0和M1巨噬细胞无明显毒性。在透明质酸酶（HAase）存在下，HydroMiR的pDNA释放加速。

**3.3 润滑性能**：UMT-3测试显示HydroMiR的COF为0.050 ± 0.008，比PBS（0.111）和PEI-FPBA/MiR（0.093）降低约55%，归因于PEG化HA外壳形成水合边界润滑膜，增强滑液粘弹性。

**3.4 摩擦后封装稳定性**：摩擦600秒后，封装效率仍保持87.5% ± 2.4%，TEM显示颗粒形态基本保持球形，仅轻微肿胀，表明机械剪切未造成显著破坏。

**3.5 细胞摄取分析**：YOYO-1标记的pDNA实验表明，在M1巨噬细胞中，HydroMiR的摄取效率达96.15%，高于PEI-FPBA/MiR（90.49%）和PEI 25K/MiR（约40%），得益于Tuftsin介导的主动靶向和R8的膜穿透能力。在M0巨噬细胞中趋势一致。

**3.6 基因转染分析**：绿色荧光蛋白（GFP）报告基因实验显示，HydroMiR在M1巨噬细胞中转染效率为22.5%，是PEI-FPBA/MiR（14.7%）的近两倍，明显优于PEI 25K/MiR（3.0%）和Lipofectamine 3000/MiR（4.0%），归因于Tuftsin和R8协同增强摄取和溶酶体逃逸。

**3.7 HydroMiR促进M2巨噬细胞极化**：流式细胞术检测CD86和CD206，在M0巨噬细胞中，HydroMiR升高CD206未改变CD86；在M1巨噬细胞中，HydroMiR降低CD86并升高CD206，同时Western blot显示IL1B下降、IL10上升，证实M0至M2极化和M1至M2复极化。

**3.8 HydroMiR促进软骨细胞生理功能**：将HydroMiR处理后的巨噬细胞条件培养基（CM）加入OA软骨细胞，Western blot显示COL II和TGFBR2升高，MMP13降低，表明CM维持了软骨细胞稳态，增强了TGF-β信号敏感性。

**3.9 促进增殖和抑制凋亡**：EdU实验表明，HydroMiR CM处理的软骨细胞增殖率显著高于空白对照。流式细胞术显示，在M0和M1共培养模型中，HydroMiR组软骨细胞凋亡率（早期+晚期）均低于空白组（M0：2.91%+3.31% vs 对照；M1：类似趋势）。

**3.10 促进迁移**：划痕实验显示，24小时时HydroMiR CM促进M0巨噬细胞条件下软骨细胞伤口闭合约80%（空白约32%），M1条件下约55%（空白约20%），增强了迁移能力。

**3.11 关节腔滞留评估**：Cy7标记的HydroMiR在关节内注射后，3天和7天荧光强度均高于非靶向HA/PEI-FPBA/MiR，表明延长了关节滞留时间。

**3.12 CT成像检查**：micro-CT分析显示，HydroMiR治疗组骨赘形成减少，软骨下骨参数如BV/TV、Tb.Th得到改善，Tb.Sp降低，表明保护了软骨下骨微结构。

**3.13 防止软骨退变**：H&E和番红O染色显示，HydroMiR组关节面光滑、软骨厚度最大、细胞数最多、组织学评分最低，证明有效延缓软骨退变。

**3.14 体内滑膜巨噬细胞极化调控**：免疫组化显示HydroMiR降低NOS2⁺（M1）细胞、增加CD206⁺（M2）细胞；ELISA显示IL1B降低、IL10升高；CD3和MPO未见显著变化，表明无脱靶免疫激活。

**3.15 体内安全性**：主要器官（心、肝、脾、肺、肾）H&E染色未见病理异常，血清生化指标（ALT、AST等）均在正常范围，提示无全身毒性。

**3.16 巨噬细胞优先摄取**：共培养实验和体内免疫荧光显示，HydroMiR被滑膜CD68⁺巨噬细胞优先内吞，而非软骨细胞或成纤维细胞。

**3.17 重塑巨噬细胞转录组**：RNA测序显示HydroMiR下调促炎基因（NLRP2、CX3CL1等），上调抗炎基因（NR4A1、CD163L1等）；GO富集分析显示“白细胞活化负调控”等免疫抑制程序；KEGG和GSEA进一步证实抑制炎症通路；Western blot显示PAK1和p-p65下调，表明miR-let-7c通过PAK1/NF-κB通路促进M2极化。

**讨论部分**：研究人员指出OA是慢性低度炎症，滑膜巨噬细胞是疾病起始和进展的关键驱动因素。传统药物和生物分子在关节腔停留时间短，重复注射风险高。HydroMiR作为多功能基因递送系统，利用miR-let-7c质粒实现长期M2极化，且不改变DNA序列，安全性更高。相比电穿孔（死亡率高达60%），HydroMiR的TRPH壳层通过巨噬细胞靶向和HAase响应释放，实现约24%的转染效率，且载体主要由临床广泛应用的HA构成，利于转化。仍需进一步优化：机制未完全阐明、体内软骨细胞功能改善是否持久、大动物验证等。

**结论部分**（翻译）：总之，为了克服通过基因疗法调控滑膜巨噬细胞表型的多重生物屏障，研究人员合理设计了基于miR-let-7c调控的核壳结构纳米平台（HydroMiR），具有分级解锁和流线型递送功能，有效复极化滑膜巨噬细胞并润滑关节，从而降低炎症并缓解OA进展。面对OA微环境，HydroMiR表现出延长关节内滞留、改善润滑、深层组织渗透以及对滑膜巨噬细胞的精准双（主动和被动）靶向、内体/溶酶体逃逸和高效基因转染，从而实现对miR-let-7c pDNA的特异性内吞和超高转染效率。HydroMiR能够激活高效精准的M2滑膜巨噬细胞，调节细胞因子分泌，进而促进软骨细胞迁移、增殖、分化和软骨基质合成。体内研究进一步验证了动态免疫调节和高效关节润滑在关节炎大鼠治疗中的作用，且毒性极小。总之，这项研究不仅证明HydroMiR可持续精准调控巨噬细胞极化并增强OA滑膜的抗炎特性，而且提供了一种通用有效的巨噬细胞基因递送系统。