发现VU6077564：一种选择性M1拮抗剂，可促进成体感觉神经元中的神经突生长

《ACS Chemical Neuroscience》：Discovery of VU6077564: A Selective M1 Antagonist That Promotes Neurite Outgrowth in Adult Sensory Neurons

　　

先前，研究人员报道了强效且高度选择性的M1拮抗剂VU0415248和VU0452865；然而，这些化合物因在大鼠中预测的肝脏清除率较高而受到限制。本研究报道了基于环丁基磺酰胺（cyclobutylsulfonamide）的VU0415248和VU0452865类似物的开发。通过这一工作，研究人员鉴定出VU6077564，一种外周限制性（peripherally restricted）且选择性的M1拮抗剂。此外，研究人员证明了VU6077564能够促进成年大鼠背根神经节（dorsal root ganglia, DRG）感觉神经元中的神经突生长（neurite outgrowth），凸显了选择性M1拮抗剂用于治疗外周神经病变（peripheral neuropathy）的潜力。

以下是根据论文主体内容撰写的解读文章：

**研究背景与问题**

乙酰胆碱（ACh）作为胆碱能系统的主要神经递质和调节剂，通过毒蕈碱型乙酰胆碱受体（muscarinic acetylcholine receptors, mAChRs）和烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptors, nAChRs）发挥效应。mAChRs家族包含M1–M5五种G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPCRs），其中M1在CNS中占mAChRs表达的60%，主要分布于大脑皮层、海马和纹状体，在突触可塑性、学习和记忆中起关键作用。M1拮抗作用已被证明对多发性硬化症、帕金森病和脆性X综合征等疾病具有治疗潜力；此外，M1也是周围神经系统（PNS）疾病的潜在治疗靶点。先前研究表明，M1拮抗剂可促进神经突生长，通过促进轴突修复在多种神经病变动物模型中发挥疗效，尤其在外周神经病变（如糖尿病神经病变）中具有转化意义。然而，已报道的选择性M1拮抗剂VU0415248和VU0452865在大鼠中预测的肝脏清除率（hepatic clearance）较高（分别为68.6 mL/min/kg和49.5 mL/min/kg），限制了其体内应用。同时，现有M1拮抗剂如羟丁宁（oxybutynin）缺乏对M1的选择性且易透过血脑屏障（blood-brain barrier），而哌仑西平（pirenzepine）虽选择性较高但CNS穿透性差。因此，需要开发具有更高选择性、外周分布优于中枢分布（CNS）的M1拮抗剂，以进一步研究M1阻断在外周神经病变治疗中的潜力。

**研究与结论**

研究人员基于VU0452865支架，通过结构-活性关系（structure-activity relationships, SAR）研究，对西部芳基、核心及东部氮杂环区域进行修饰，开发了一系列环丁基磺酰胺类似物。通过钙动员实验（calcium mobilization assay）筛选化合物的M1拮抗活性，并用渐近倍率移位实验（progressive fold-shift, PFS）结合Schild分析确认作用机制，发现化合物VU6077564（31d）是强效、高选择性的M1拮抗剂，对大鼠和人的M1具有纳摩尔级活性（hM1 IC₅₀ = 31 nM，rM1 IC₅₀ = 39.5 nM），对M2–5亚型的选择性>100倍（IC₅₀ > 10 μM）。体内药代动力学（PK）研究显示，VU6077564在大鼠中表现为高清除率（CLp = 71.7 mL/min/kg）、长半衰期（t_1/2 = 35.2 h）和大分布容积（Vss = 27.6 L/kg），且为外周限制性（脑-血浆总药浓度比Kp = 0.08，未结合药物分布比Kp,uu = 0.13，外排比ER = 46.6）。随后，研究人员评估了VU6077564对成年大鼠DRG感觉神经元神经突生长的影响：在低剂量神经营养因子（LDGF）存在下，以100 nM和300 nM处理42小时，可统计学显著地使总神经突生长升高1.7倍（ED₅₀ = 55 nM），且不影响神经元存活。这一发现支持了选择性M1拮抗剂在PNS轴突退行性疾病中的治疗潜力。相关成果发表在《ACS Chemical Neuroscience》。

**主要关键技术方法**

1. **平行合成策略**：采用迭代平行合成方法制备化合物，包括Boc-脱保护、磺酰胺形成、HATU酰胺偶联等步骤。
2. **钙动员功能实验**：在稳定表达人/大鼠M1–M5受体的CHO细胞中，以乙酰胆碱（ACh）EC₈₀浓度刺激，测定化合物引起的钙信号抑制，计算IC₅₀。
3. **渐近倍率移位实验与Schild分析**：通过不同浓度拮抗剂下ACh激动曲线的右移，测定拮抗剂的平衡解离常数（K_B），证实可逆竞争性拮抗作用。
4. **代谢软点分析**：在大鼠S9组分中孵育后，通过LC-MS鉴定代谢产物，确定主要代谢脆弱位点。
5. **体内药代动力学（PK）实验**：雄性Sprague–Dawley大鼠（n=2）经静脉给药（0.2 mg/kg），测定清除率、分布容积、半衰期及脑-血浆分配系数（Kp, Kp,uu）。
6. **神经突生长测定**：成年大鼠DRG感觉神经元在低剂量神经营养因子和不同浓度化合物下培养42小时，固定后行peripherin染色，定量总神经突长度。

**研究结果（保留每个小标题）**

**1. 结构-活性关系（SAR）研究**
- **氮杂环丁烷与环丁烷修饰**：尝试氮杂环丁烷的氟化（10）及甲基化（11）均导致M1活性下降>3倍（hM1 IC₅₀分别为2440 nM和1850 nM）；将氮杂环丁烷替换为环丁烷（15、16）或环丁胺（20、21）后活性极弱（hM1 IC₅₀ > 10 μM）。
- **喹啉-5-磺酰胺优化**：在22b中引入喹啉-5-磺酰胺（替换异喹啉-5-磺酰胺），M1活性较前体提升>3倍（hM1 IC₅₀ = 138 nM），且对M2–5选择性优良（hM2 IC₅₀ = 7.7 μM，hM3–5 IC₅₀ > 10 μM），但大鼠肝脏清除率仍高（rCLhep = 63.0 mL/min/kg）。
- **代谢软点分析**：对22b在大鼠S9组分中鉴定出5个代谢物，以喹啉部分氧化产物（M467b，17%）和吡啶-哌嗪部分氧化产物（M515，10%）为主。
- **哌嗪环修饰**：哌嗪的八氘代（23a）导致6倍活性丢失；甲基化（23b–e）及哌啶替换（23f）均活性下降；而3,7-二氮杂双环[3.3.0]辛烷类似物23g活性优秀（hM1 IC₅₀ = 70 nM）但清除率仍高；3,9-二氮杂双环[4.2.1]壬烷类似物23h活性相当（hM1 IC₅₀ = 150 nM）但对M2选择性降低（hM2 IC₅₀ = 890 nM）。
- **2-吡啶环修饰**：3-吡啶类似物24a活性可接受（hM1 IC₅₀ = 96 nM）但清除率高；5-或6-位取代（24b–24e）耐受良好（IC₅₀ ≤ 105 nM）但清除率未改善；24c（5-甲基-2-吡啶）活性优异（hM1 IC₅₀ = 5.8 nM）；6-甲基化（24h）保留高活性（hM1 IC₅₀ = 11 nM）并适度改善清除率（rCLhep = 41.0 mL/min/kg）；1,8-萘啶类似物24l活性优秀（hM1 IC₅₀ = 10 nM）但清除率仍高。
- **西部芳基环修饰**：以24h为母核，4-喹啉（28a）及其他双环（28b–d）耐受（IC₅₀ < 150 nM）但清除率高；8-位甲基化（28e）活性大幅下降（IC₅₀ = 1.9 μM）；8-氟化（28f）活性良好（hM1 IC₅₀ = 71 nM），清除率与24h类似（rCLhep = 43.0 mL/min/kg）。
- **哌嗪甲基扫描**：基于28f，在哌嗪环上引入甲基（31a–c）导致活性下降>5倍（IC₅₀ = 390–1130 nM），但清除率略有改善；而(S)-甲基取代的31d活性提高约2倍（hM1 IC₅₀ = 31 nM），清除率中等（rCLhep = 40 mL/min/kg）。
**2. 候选化合物的深入表征**
- 选择24h、28f和31d进行进一步评估。24h对M2选择性仅12倍；而28f和31d对M2选择性>140倍（hM2 IC₅₀ > 10 μM）。
- 28f和31d对M3–5的IC₅₀均>10 μM，表现出优异选择性。渐进倍率移位实验确认二者为可逆竞争性拮抗剂：hM1 K_B分别为25 nM和30 nM，rM1 K_B分别为22 nM和12 nM。
- 体内PK：28f为低清除率（CLp = 17.6 mL/min/kg）、短半衰期（t_1/2 ≈ 20 min）、低分布容积（Vss = 0.32 L/kg），低CNS穿透（Kp = 0.03，Kp,uu = 0.05）；31d为高清除率（CLp = 71.7 mL/min/kg）、长半衰期（t_1/2 = 35.2 h）、高分布容积（Vss = 27.6 L/kg），低CNS穿透（Kp = 0.08，Kp,uu = 0.13）。
**3. 神经突生长实验**
- 31d（VU6077564）在0–1000 nM浓度下处理成年大鼠DRG感觉神经元42小时，发现100 nM和300 nM可显著促进总神经突生长（约1.7倍），ED₅₀ = 55 nM，与rM1功能效力（IC₅₀ = 39.5 nM）和结合亲和力（K_B = 12 nM）一致，且对神经元无毒性。

**讨论与结论部分总结**

论文总结部分指出，研究人员鉴定出VU6077564（31d）作为一类新型强效、高选择性环丁基磺酰胺基M1拮抗剂的先导化合物。VU6077564在大鼠体内呈现高清除率，且为外周限制性（Kp = 0.08, Kp,uu = 0.13, ER = 46.6）。本工作证明了VU6077564能够促进培养的成年DRG感觉神经元中神经突生长，进一步支持外周限制性、选择性M1拮抗剂在治疗周围神经系统轴突退行性疾病（如糖尿病神经病变、化疗诱导性外周神经病变和HIV神经病变）中的治疗潜力。此外，本研究从改善体内清除率方面获得了有价值的经验，详细信息将在后续报道中公布。
（翻译研究结论部分：总体而言，我们鉴定出VU6077564（31d）作为一类新型强效且高度选择性的环丁基磺酰胺基M1拮抗剂的先导化合物。VU6077564在大鼠体内呈现高清除率，且是外周限制性的（Kp = 0.08, Kp,uu = 0.13, ER = 46.6）。在此，我们证明了VU6077564能够促进培养的成年DRG感觉神经元中神经突生长，进一步支持外周限制性、选择性M1拮抗剂在治疗外周神经系统轴突退行性疾病（如糖尿病神经病变、化疗诱导性外周神经病变和HIV-神经病变）中的治疗潜力。此外，本研究还获得了关于改善体内清除率策略的宝贵经验，其细节将在适当时候报告。）