Aerides odorata的化学成分及其对LPS激活的BV2小胶质细胞的抗神经炎症作用

《ACS Omega》：Chemical Constituents of Aerides odorata and Their Anti-Neuroinflammatory Effects on LPS-Activated BV2Microglial Cells

　　

对Aerides odorata全草进行的综合性植物化学研究分离得到21个化合物，包括两个新的菲衍生物（1–2）、一个新的不可分离的对映体橙酮苷（3）以及18个已知化合物（4–21）。新化合物的结构通过广泛的光谱分析得以阐明，包括核磁共振（NMR）、质谱（MS）、紫外（UV）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、旋光度和圆二色（CD）数据。部分分离化合物在脂多糖（LPS）激活的BV2小胶质细胞中评估了其抗炎特性。其中，gigantol (5)、nudol (6)、coelonin (9)、dihydrocorniferyl dihydro-p-coumarate (10)、aerifalcatin (14)和5-methoxy-9,10-dihydroxyphenanthrene-2,3,7-triol (20)对一氧化氮（NO）的产生表现出强效抑制活性，IC₅₀值分别为1.82 ± 0.34、4.88 ± 0.24、2.42 ± 0.11、4.67 ± 0.49、1.37 ± 0.15和0.83 ± 0.15 μM。此外，化合物6、10和20以浓度依赖性方式显著减弱了促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）的释放。值得注意的是，化合物20似乎通过调节核因子-κB（NF-κB）依赖性信号通路选择性调节小胶质细胞介导的神经炎症，导致关键促炎细胞因子的产生减少。

神经炎症是中枢神经系统（CNS）的一种复杂免疫过程，在阿尔茨海默病、帕金森病和多发性硬化等神经退行性疾病的发生与发展中扮演关键角色。其核心特征之一是小胶质细胞（microglia）的激活：在组织损伤、β-淀粉样蛋白积聚或脂多糖（LPS）等病理刺激下，这些脑内驻留免疫细胞从静息态转变为活化表型，释放包括一氧化氮（NO）、前列腺素和细胞因子在内的多种促炎介质，进而导致神经元损伤。核因子-κB（NF-κB）依赖性信号是调控炎症和免疫反应的核心分子通路，通过控制促炎细胞因子和介质的转录发挥作用，其失调最终导致慢性炎症和神经退行性疾病。当前针对神经炎症的治疗策略主要涉及非甾体抗炎药、皮质类固醇和免疫调节剂，但长期使用常伴随疗效有限和不良副作用。已有研究报道姜黄素、白藜芦醇和槲皮素等植物来源化合物可通过调节氧化应激、小胶质细胞激活及NF-κB等炎症信号通路发挥神经保护与抗神经炎症活性。此外，从药用植物中分离的众多酚类化合物和生物碱也被报道可抑制活化小胶质细胞中NO和促炎细胞因子的产生。这些发现突显了天然产物研究在发现针对神经炎症相关CNS疾病的新型药物方面的重要性。

Aerides odorata Lour.（兰科Orchidaceae）是一种原产于亚热带和热带地区的植物，在泰国被称为“Ueang kulap krapaopit”。民间传统上将其用于治疗皮肤疾病、结核病、切割伤与创伤、肺炎、炎症以及胸部和胃部不适等疾病，其杀菌特性也早已被认知。既往研究报道A. odorata含有生物碱、苷类、黄酮类、皂苷、鞣质、萜类、甾体和蒽醌类成分，并证实其提取物具有抗氧化活性和浓度依赖性的肝保护作用。此外，A. odorata叶片的乙酸乙酯和甲醇提取物对MCF-7和HeLa两种癌细胞系表现出抗癌活性。然而，此前尚未有对该植物进行详细植物化学研究的报道。基于研究人员对兰科植物中生物活性化合物的持续兴趣，以及前期发现A. odorata乙酸乙酯（EtOAc）提取物（100 μg/mL）可抑制LPS刺激的BV2小胶质细胞中NO产生超过80%，研究人员开展了本研究，首次系统探索A. odorata的化学成分并评价其抗神经炎症活性成分。

研究人员从2 kg A. odorata全草干燥粉末中，经甲醇浸提、乙酸乙酯萃取得到EtOAc提取物（79.6 g），随后使用真空液相色谱、正相硅胶柱色谱及Sephadex LH-20凝胶过滤色谱进行系统分离纯化，共获得21个化合物，包括2个新菲衍生物——aeriodin A（1）和aeriodin B（2），1个新的不可分离对映体橙酮苷——maesopsin-4-O-α-L-鼠李糖苷（3），以及18个已知化合物（4-21）。结构鉴定综合运用了核磁共振（NMR）、高分辨质谱（HR-ESI-MS）、紫外光谱（UV）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、旋光度、圆二色（CD）光谱和密度泛函理论（DFT）计算ECD等方法。活性评价使用BV2小胶质细胞（购自AcceGen Biotechnology，美国），通过3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法测定细胞活力，Griess法检测NO产生，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测TNF-α和IL-6水平，蛋白质免疫印迹（Western blot）分析NF-κB通路蛋白表达。

**结构鉴定（Structural Determination）**：新化合物1（aeriodin A）为棕色无定形固体，分子式C₂₆H₂₄O₈，光谱解析显示其具有菲骨架和一个经醚键连接形成二氢吡喃环的苯丙烷单元，通过CD谱与已知化合物(+)-fisetinidol比较确定为(7′R,8′S)构型。新化合物2（aeriodin B）也为棕色无定形固体，同分异构体，但含有一个二氢呋喃环，通过计算ECD谱匹配确定为(7′R,8′R)构型。新化合物3为不可分离的对映体橙酮苷，其苷元为maesopsin，糖部分为α-L-鼠李糖，连接于C-4位，因其半缩酮结构在C-2位形成一对非对映异构体导致NMR信号成1:1比例。18个已知化合物涵盖菲类、联苄类、二氢菲类、苯丙酸酯、苯甲酸衍生物、黄酮类、木脂素和酰胺等类型。

**分离化合物在BV2小胶质细胞中的细胞毒性评价（Cytotoxicity Evaluation）**：在0–40 μM浓度范围内，除化合物2和13在5 μM时显著降低细胞活力（分别降至77.10%和31.42%）外，其余测试化合物（包括1、3、4、5、6、7、9、10、14、18、19、20、21）在5 μM浓度下均未显著影响细胞活力，因此选定5 μM为安全浓度进行后续活性评价。

**测试化合物对活化小胶质细胞中一氧化氮释放的抑制（Inhibition of Nitric Oxide Release）**：在5 μM非毒性浓度下，化合物5（gigantol）、6（nudol）、9（coelonin）、10（dihydrocorniferyl dihydro-p-coumarate）、14（aerifalcatin）和20（5-methoxy-9,10-dihydroxyphenanthrene-2,3,7-triol）表现出显著的NO抑制活性，IC₅₀值分别为1.82、4.88、2.42、4.67、1.37和0.83 μM，均强于阳性对照米诺环素（IC₅₀ = 7.66 μM）。新化合物1和3在此浓度下未显示显著活性，可能因其刚性骨架、甲氧基取代模式或糖基化影响了游离酚羟基的可用性或细胞摄取。化合物2因量少且在5 μM时具有细胞毒性而未纳入NO抑制评价。

**选定化合物对LPS诱导小胶质细胞中TNF-α和IL-6表达的调节（Modulation of TNF-α and IL-6 Expression）**：研究人员进一步评价了化合物6、10和20（5 μM和10 μM）对LPS刺激BV2小胶质细胞中促炎细胞因子TNF-α和IL-6分泌的影响。ELISA结果显示，LPS刺激后TNF-α和IL-6水平显著升高，而预处理这三种化合物均能浓度依赖性地显著降低这两种细胞因子的释放。其中化合物20（二氢菲衍生物）因额外羟基取代可能增强了氢键作用及靶点相互作用，显示出比结构类似物coelonin（9）更强的抑制效果。该研究首次揭示了化合物6、10和20的抗神经炎症活性，突显了菲骨架和苯丙烷骨架在调节神经炎症中的重要性。

**化合物20抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞中NF-κB激活和TNF-α表达（Compound 20 Suppresses LPS-Induced NF-κB Activation and TNF-α Expression）**：基于化合物20对NO产生的最强抑制活性（IC₅₀ = 0.83 μM），研究人员通过Western blot探究其机制。与对照组相比，LPS刺激显著增加了p-NF-κB/NF-κB比值和TNF-α蛋白表达；而化合物20预处理则显著减弱了LPS诱导的NF-κB磷酸化并降低了TNF-α蛋白水平。单独给予化合物20不引起p-NF-κB/NF-κB比值或TNF-α表达的显著变化，说明其在基础条件下不诱发炎症。这表明化合物20可能通过调控NF-κB依赖性信号通路选择性调节小胶质细胞介导的神经炎症，从而减少关键促炎细胞因子TNF-α的产生。

**结论（Conclusion）**：总之，对Aerides odorata全草的植物化学研究分离得到21个化合物，包括3个新化合物（1–3）和18个已知化合物（4–21）。其中，gigantol (5)、nudol (6)、coelonin (9)、dihydrocorniferyl dihydro-p-coumarate (10)、aerifalcatin (14)和5-methoxy-9,10-dihydroxyphenanthrene-2,3,7-triol (20)表现出显著的NO抑制活性，IC₅₀值范围为0.83 ± 0.15至4.88 ± 0.24 μM。此外，nudol (6)、dihydrocorniferyl dihydro-p-coumarate (10)和5-methoxy-9,10-dihydroxyphenanthrene-2,3,7-triol (20)在LPS刺激的BV2小胶质细胞中以浓度依赖性方式显著减少了TNF-α和IL-6的分泌。该研究首次揭示了化合物6、10和20的抗神经炎症作用，特别强调了化合物20作为针对小胶质细胞介导神经炎症的新型治疗药物开发中的有前途的先导化合物。