综述：肝包虫病中单细胞转录组测序的进展

《Frontiers in Immunology》：Advances in single-cell transcriptomic sequencing in hepatic echinococcosis

　　

包虫病是一种由棘球绦虫成虫或幼虫引起的慢性寄生虫病，也是严重的人兽共患感染性疾病。包虫病的传播依赖于作为终末宿主的食肉动物和作为中间宿主的不同动物。根据当前流行病学报告，肝脏是最常受累的器官。临床上，肝包虫病分为肝泡型包虫病和肝囊型包虫病，两者均严重威胁流行区居民的生活质量。目前，手术治疗联合苯并咪唑类药物是主要疗法；然而，可用的化疗药物和靶向治疗较少，临床治疗仍存在局限性。因此，迫切需要在分子免疫学和细胞方向进行新的探索。近年来，随着高通量测序技术的发展，空间转录组学和单细胞转录组学的整合分析在临床研究中变得更加可行，为肝包虫病的研究提供了新途径。本综述聚焦于近年来单细胞RNA测序在肝包虫病中的应用，以及在分子免疫发病机制、分子诊断、转移、细胞异质性、生长发育以及人类宿主与棘球绦虫相互作用方面的研究。研究人员特别关注病灶周围浸润免疫细胞的异质性、细胞亚群分类、免疫抑制及免疫微环境，这有助于临床医生更好地理解肝包虫病的分子免疫机制和生物学特征，为探索新的药物治疗靶点提供参考。

**1 结果**
**单细胞RNA测序**
批量RNA测序（bulk RNA-seq）是一种经典测序技术，其核心过程是从细胞或组织样本中提取RNA并将所有RNA混合后进行测序。然而，与单细胞测序（SCS，scRNA-seq）相比，两种方法在分析规模和检测灵敏度方面存在显著差异。Bulk RNA-seq提供细胞群体的平均表达谱，而scRNA-seq可在单细胞分辨率下揭示细胞异质性。与传统的bulk RNA-seq技术相比，SCS具有独特优势，能够通过对单个细胞的详细分析，有效识别和表征在批量测序中容易被掩盖的稀有细胞群体或异质性细胞亚群。这种高分辨率分析方法是揭示细胞群体复杂性和多样性的强大工具。SCS的标准工作流程包括单个细胞的分离，随后从细胞中提取RNA，通过逆转录将RNA转化为cDNA，进行预扩增以增加cDNA量，并使用高灵敏度检测方法分析和检测基因表达。对于大规模样本测序，scRNA-seq的高成本已成为许多研究人员面临的挑战性问题，并阻碍了该领域的研究进展。为克服这一问题，研究人员通过整合scRNA-seq数据并使用参考谱对bulk RNA-seq数据进行反卷积分析，成功构建了单细胞基因表达谱。然而，反卷积方法并非没有缺陷，其有效性严重依赖于scRNA-seq参考数据。如果参考数据与目标样本不匹配，或参考数据中的细胞注释存在错误，这些因素会显著降低反卷积的准确性和可靠性。最新一批基于反卷积算法开发的在线工具包括MuSiC2、TIMER2.0、BayesPrism、Coex和Bisque。此外，目前单细胞基因组学和空间转录组学各有优势，将两者结合在新的多组学应用中，可以充分利用两者优势，并将其应用于未来的基因组学研究（表2）。

**2 单细胞测序技术在肝包虫病中的应用**
**2.1 分析肝包虫病中肝包虫病变的异质性**
**2.1.1 分析囊型包虫病（CE）中肝包虫病变的异质性**
CE是一种已在全球范围内传播的人兽共患病。既往研究表明，多种浸润性免疫细胞可在病灶周围积聚并形成独特的微环境。然而，肝脏CE微环境的细胞组成和异质性尚未完全清楚，需进一步研究。一些研究发现，细粒棘球绦虫在长期寄生过程中逐渐进化出一套精巧而复杂的机制，可规避宿主的强烈免疫反应，并在宿主免疫系统与寄生虫自身生长之间维持微妙而稳定的长期平衡。寄生虫是研究免疫调控的关键生物学模型。它们的生存依赖于宿主与病原体之间的动态平衡，通过组织侵袭和免疫逃避的寄生策略来维持。宿主免疫必须平衡病原体清除与防止过度自身损伤：过度活跃的免疫会清除寄生虫，而免疫抑制则因寄生虫不受控制的增殖而面临宿主死亡风险。至关重要的是，在寄生虫达到生殖成熟之前发生的破坏会威胁病原体种群的可持续性。值得注意的是，寄生虫经常利用宿主免疫组分（如调节性T细胞、TGF-β）来完成其生命周期，而宿主免疫反应则表现出保护性和有害性的双重作用。例如，曼氏血吸虫引起的门静脉纤维化和恶性疟原虫引起的脑型疟疾病理学是宿主免疫防御导致的继发性组织损伤。这些病理变化与免疫反应强度和调控模式直接相关，强调了宿主-寄生虫关系中复杂的共进化相互作用。最近，单细胞测序已应用于肝细胞癌的癌细胞和免疫细胞，以揭示癌症微环境中免疫细胞的动态异质性（表3）。2021年，Aimaiti Yasen团队对CE进行了单细胞RNA测序，揭示了肝脏免疫细胞浸润的异质性。对来自PB、PL和AN肝组织的81,865个免疫细胞进行分析，鉴定出23个具有组织特异性变化的独特亚群。尽管PL和AN（表1）的免疫谱相似，但PL组织中2型先天性淋巴细胞（ILC2）和浆细胞样树突状细胞（pDCs）的比例升高，同时免疫抑制基因NFKBIA表达上调。PL区域中CD4⁺ T细胞、ILC2和pDC之间的增强相互作用通过增加NKG2A/HLA-E检查点表达促进免疫抑制微环境。实验验证证实PL组织中NFKBIA和NF-κB水平高于AN组织，强调了它们在宿主-寄生虫免疫动态中的作用。研究人员还发现，与AN组织相比，PL组织显示出调节性CD4⁺ T细胞和Th2-CD4⁺ T细胞的富集。PL区域中CD4⁺ T细胞、ILC2和pDC之间的增强相互作用上调了免疫抑制检查点基因NKG2A/HLA-E，同时抑制了促炎信号，促进了CE病变中的抑制性微环境。实验验证证实PL组织中NFKBIA和NF-κB水平升高。这表明NFKBIA通过抑制NF-κB信号来减弱局部免疫反应，从而促进寄生虫生存。这些发现为CE发病机制和潜在治疗靶点在细胞水平上提供了见解。

**2.1.2 分析泡型包虫病（AE）中肝包虫病变的异质性**
2022年，Jiang等人使用scRNA-seq和单细胞TCR测序（scTCR-seq）从4名AE患者的PB、PL和AN肝组织样本中分离CD45⁺细胞。他们的结果揭示了慢性AE感染者肝脏浸润淋巴细胞的单细胞异质性，并提供了相关免疫机制的见解。在AN患者的肝组织中分析了总计83,921个CD45⁺淋巴细胞，并鉴定出23个大细胞亚群。这些细胞亚群在肝脏和肝周微环境中的分布和转录组特征存在显著差异。特别是，PL组织中耗竭的CD8⁺ T细胞和ILC2的比例显著增加。在这些细胞类型中，CD8⁺ T细胞在免疫反应中发挥细胞毒性作用。深入研究后发现，这些细胞亚群的表达特征与抑制病变转移和免疫反应密切相关。对5个CD8⁺ T细胞亚群的分析显示，仅CD8⁺黏膜相关恒定T（MAIT）细胞在PL样本中富集，且TRAV1-2_TRAJ33_TRAC TCR扩增。在对11个CD4⁺ T细胞亚群的研究中，Th17细胞和诱导性调节性T细胞（iTregs）在PL样本中显示出优先富集特征，其高表达基因与细胞侵袭行为、抑制AE转移机制和炎症免疫反应密切相关。值得注意的是，这些信息为进一步研究疾病相关免疫机制提供了关键依据。在这些免疫抑制状态下收集的证据表明，这种状态显著促进了疾病进展，导致AE在超出正常免疫监视范围后失控增殖。在这种状态下，AE增殖并侵袭形成不断增大的肝病变，主要由AE囊泡群体组成，这些囊泡主要与宿主结缔组织和浸润免疫细胞结合。最近，对人类AE肝脏标本的组织病理学分析显示，周围的免疫浸润由巨噬细胞、淋巴细胞、粒细胞和肌成纤维细胞组成。在该样本中，发现CD4⁺和CD8⁺ T细胞亚群在肝脏AE病灶周围积聚。这些发现为优化AE免疫治疗策略和制定疾病防控措施提供了关键参考，也阐明了免疫系统在维持健康和防御寄生虫感染中的核心作用。

2024年，Wang Maolin等人使用多种先进技术对AE患者的免疫机制进行了全面深入的探索。首先，利用单细胞RNA测序技术分析AE患者近肝组织（CLT）中耗竭的CD8⁺ T细胞上CD244的表达特征，并精确确定其基因表达模式。同时，使用免疫组织化学和免疫荧光对CD244的表达进行可视化和定位，以确保在组织和细胞水平上获得准确的表达信息。此外，利用流式细胞术以及体外和体内模型，全面评估CD244对AE患者CD8⁺ T细胞分化趋势和效应功能的影响，并深入探讨其在免疫细胞功能调控网络中的关键作用。为了从细胞能量代谢的角度阐明CD244的机制，通过测量活性氧（ROS）产生水平和耗氧率（OCR）的变化，系统评估了CD244在CD8⁺ T细胞线粒体功能中的具体作用。研究发现，CLT中的CD244⁺ CD8⁺ T细胞表现出终末分化表型特征，且IFN-γ和TNF-α细胞因子的分泌显著减少。体外实验表明，来自CD244缺陷小鼠的CD8⁺ T细胞表现出产生更高水平IFN-γ、TNF-α和颗粒酶B的独特能力，表明CD244缺失可能改变CD8⁺ T细胞的功能状态。进一步的体内研究揭示，CD244缺陷显著增强了CD8⁺ T细胞分泌IFN-γ和TNF-α的能力，这种增强的免疫细胞功能的直接作用有效抑制了多房棘球绦虫的生长。值得注意的是，这一发现为使用免疫疗法治疗该疾病提供了潜在方向。此外，在细胞代谢水平上的研究发现，CD244缺陷引发肝脏CD8⁺ T细胞的变化，表现为ROS水平降低和细胞中三磷酸腺苷（ATP）连接的OCR显著增加。这表明CD244可能在调节CD8⁺ T细胞代谢和功能中发挥关键作用，并且CD244通过介导CD8⁺ T细胞的免疫耗竭促进AE疾病进展。这一观察也提高了我们对CD244在AE疾病过程中作用机制的理解，并为后续开发针对该疾病的精准免疫治疗策略开辟了新途径，为未来研究提供了潜在方向和靶点。

**2.2 揭示转移机制**
AE是一种“恶性寄生虫病”，具有慢性、进行性和浸润性生长的特征。如果意外摄入多房棘球绦虫虫卵，可进入十二指肠，随后超过70%的摄入虫卵进入门静脉系统并滞留在肝脏，最终形成AE。AE可累及整个肝脏，破坏其解剖结构并损害肝功能。AE的药物治疗主要包括苯并咪唑类、阿苯达唑和甲苯达唑；然而治疗周期长。如果没有有效干预，病情会逐渐恶化，当病变扩张并侵蚀胆道时，大多数患者会出现梗阻性黄疸。如果液化腔发生继发感染，也可能形成脓肿。如果大范围病变侵蚀大部分肝组织，还可能引起门静脉高压和肝功能不全，患者最终可能死于肝功能衰竭、胆道系统感染以及向肺、脑等器官的转移。

肝AE可通过侵袭、种植转移以及血行和淋巴途径转移至肺、脑、肾脏及周围组织。然而，关于肝AE淋巴结转移的研究相对缺乏，区域淋巴转移的确凿证据仍然不足。淋巴结转移可能发生，因为AE利用肝脏深部和浅表的多向淋巴回流通路引流至区域淋巴结。尽管已有一些相关研究报告，但在淋巴结转移领域仍缺乏更广泛、更系统的文献，以明确诊断和治疗的标准规范。2022年，Jiang等人在一项关于慢性多房棘球绦虫感染者肝脏浸润淋巴细胞单细胞异质性的研究中，使用单细胞RNA和TCR测序分析了四名晚期AE患者获得的样本。从PB、PL和AN肝组织中分离了总计83,921个CD45淋巴细胞。经过仔细分析和鉴定，确定了23个大细胞亚群。这些细胞亚群在肝脏和外周血中的分布以及转录组特征存在显著差异。PL组织中耗竭的CD8⁺ T细胞和ILC2细胞的比例显示出显著增加的趋势。此外，在对五个不同CD8⁺ T细胞群体的研究中，观察到一个独特现象：仅CD8⁺黏膜相关恒定T（MAIT）细胞在PL样本中显著富集，并且TRAV1-2_TRAJ33_TRAC TCR也显示出克隆扩增。在分析11个CD4⁺ T细胞亚群时，Th17细胞和诱导性调节性T细胞（iTregs）在PL样本中观察到优先聚集。对这些细胞的深入研究揭示，它们高表达的基因在细胞侵袭、病变转移和抑制炎症免疫反应中发挥重要作用。

**2.3 揭示分子免疫诊断方法**
**2.3.1 诊断技术在包虫病中的应用**
包虫病的临床表现往往不特异，大多数患者在疾病进展到晚期才出现症状。这一特点使得该病的诊断较为困难，尤其是在早期阶段。在众多诊断方法中，超声成像因其经济优势和快速诊断而成为临床上最常用的方法。此外，高分辨率成像技术如计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）被广泛用于检测特定解剖部位的病变和非典型包虫病。这些成像技术的一个显著限制是无法准确区分棘球蚴囊肿与其他类型的囊肿。此外，成像分析通常依赖于CE患者晚期阶段存在相对较大的囊肿，这限制了早期诊断的可能性。血清学检测在诊断时效性方面可能优于成像技术，并且能比其他方法更早地识别疾病。血清学检测可作为辅助诊断工具；然而其局限性包括潜在的交叉反应性以及无法区分当前感染和既往感染。此外，使用成像技术难以识别小的囊性病变。棘球蚴囊肿不易与由其他疾病引起的囊肿区分，例如肝脓肿、Caroli病、胆管囊肿和囊腺瘤。该病潜伏期长且临床表现复杂，使得临床诊断困难。建议对有症状的患者及时进行成像和血清学检测，仅凭临床发现诊断价值有限。目前已成功开发出多种免疫学方法。然而，这些免疫学检测的灵敏度和特异性尚未确定，并且可能因检测环境、样本特征和其他因素而波动，尤其是在CE检测中。AE和CE的分子诊断方法主要包括血清学检测、抗原检测、细胞免疫测定、PCR分子诊断和新型生物标志物检测。血清学检测主要包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹试验、间接血凝试验（IHA）和免疫荧光抗体试验（IFAT）等方法。鉴于现有诊断工具的局限性，使用高通量测序检测棘球绦虫释放到外周循环中的游离DNA，有望提供一种潜在的新型病因学生物标志物。在常规筛查中，AE和CE可使用类似基于抗体的方法（如ELISA）进行检测，因为两种寄生虫共享共同的抗原表位，并且这些检测方法均旨在检测针对棘球绦虫的特异性抗体。

**2.3.2 单细胞测序在CE诊断中的应用**
2020年，Ji J等人使用超高通量测序技术（即单细胞测序技术）对包虫病患者血浆中的棘球绦虫游离DNA进行了系统分析。他们的研究证实了该生物标志物在包虫病临床诊断中的潜在应用价值。值得注意的是，研究结果证实了该生物标志物在包虫病临床诊断中的潜在应用价值。从23名包虫病患者收集血浆样本以探索疾病的分子特征。首先从收集的血浆样本中提取总cfDNA，并使用高通量测序平台进行测序。测序后，每个血浆样本平均获得2.82亿个读段对。为进一步研究测序数据中的关键信息，使用生物信息学工作流程结合棘球绦虫序列数据库分析测序数据。成功鉴定出游离棘球绦虫读段后，研究发现这些读段占总洁净读段的比例范围为1.8e-5至4.0e-9。进一步比较棘球绦虫与人类cfDNA的片段长度分布显示，CE中游离棘球绦虫DNA的长度范围较广。相比之下，AE的游离棘球绦虫DNA在约135 bp处显示出显著峰值。此外，研究发现大多数游离棘球绦虫DNA读段来源于均匀分布的核基因组，这一现象可能表明游离棘球绦虫DNA的随机释放模式。通过超高通量测序分析了包虫病患者血浆中游离棘球绦虫DNA的浓度、片段长度和释放来源。更好地了解血浆中游离棘球绦虫DNA的特征可能为其未来作为诊断生物标志物的应用提供支持。

目前，该检测方法已通过多中心临床试验验证，并成功证实了其从基础研究向临床诊断技术转化的应用前景。棘球绦虫释放到外周循环中的游离DNA是包虫病的潜在诊断生物标志物。游离DNA检测已成功应用于多种寄生虫病的检测，包括疟原虫感染、锥虫病和利什曼病。游离DNA由细胞外释放或细胞凋亡/坏死产生的核酸片段组成，主要分布在血浆、尿液和脑脊液等体液中。其在血浆和血清中的存在已被研究，并且可以通过高灵敏度PCR技术（如qPCR或ddPCR）稳定检测和定量。2020年，Wan Z等人对包虫病患者血浆中的cfDNA进行了测序，并确认了患者样本中棘球绦虫DNA的存在。为提高该检测方法的灵敏度，他们开发了一种基于重复区域靶向新一代测序的创新方法。模拟结果显示，靶向测序技术极为灵敏，在1 mL血浆中仅可检测到0.1%的棘球绦虫基因组。该方法在患者血浆样本的实际检测中表现良好，ROC曲线下面积（AUC）为0.862，检测灵敏度为62.50%，特异性高达100%，相应的约登指数为0.625。该研究为利用棘球绦虫释放到血浆中的cfDNA片段进行诊断提供了有力证据。通过重复区域靶向测序方法实现了对棘球绦虫感染的高度特异性检测。这一成就为潜在的包虫病无创筛查和诊断开辟了新途径，有望推动相关医疗检测技术的发展和创新，从而为患者带来更便捷、高效的诊疗解决方案。高通量测序技术的快速进步使cfDNA测序在研究和医疗环境中变得可行。与基于靶标的PCR相比，测序可以提供更全面的cfDNA信息。使用单细胞测序技术检测包虫病患者血浆中的游离棘球绦虫DNA具有高灵敏度和特异性，但其局限性也很明显。血浆中寄生虫DNA含量极低，易受宿主DNA干扰，需要深度测序和生物信息学优化，成本高，数据分析复杂，难以满足快速临床诊断需求，并且缺乏统一的检测流程、阈值标准和临床验证指南。

目前，包虫病的诊断依赖于影像学（超声、CT、MRI），这是定位病灶的金标准。血清学检测（ELISA、Western blotting）检测特异性抗体；然而与其他寄生虫存在交叉反应性。靶向PCR对特定寄生虫线粒体基因敏感，但需要预先靶向病原体。且其局限性和优势存在各种差异。对于具有潜力的诊断生物标志物cfDNA，计划开展一项前瞻性临床队列研究，纳入不同疾病阶段的肝包虫病患者、健康人群和其他肝脏疾病患者作为对照。对于具有前景的诊断生物标志物cfDNA，计划启动一项前瞻性多中心临床观察性研究。该研究将连续纳入不同疾病阶段的肝包虫病患者，包括新诊断病例、活动期病例和术后随访病例。同时，健康个体以及患有其他良恶性肝病（如病毒性肝炎、肝硬化和肝肿瘤）的患者将被纳入作为对照组。所有参与者的外周血血浆样本将以标准化方式收集，用于cfDNA提取、文库构建和测序分析。同时记录相应的临床影像指标、实验室生化参数和长期随访数据。通过比较不同组间cfDNA浓度和片段特征的差异，旨在系统评估cfDNA在肝包虫病早期鉴别诊断、疾病活动性动态监测、术后复发预警和预后评估中的诊断性能。计算包括灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值的相关指标，以构建针对性的临床诊断预测模型。这项前瞻性临床研究有望阐明cfDNA在肝包虫病诊疗中的临床应用价值。它将填补当前相关研究仅局限于基础相关性分析的空白，并推动cfDNA从实验性生物标志物向临床筛查和长期监测的无创便捷辅助工具转化，为肝包虫病的精准诊疗提供新的证据（表4）。

**2.3.3 单细胞测序在AE诊断中的应用**
近年来，单细胞RNA测序和空间转录组学技术已被广泛用于鉴定新型诊断生物标志物和筛选针对泡型包虫病（AE）的抗体诊断靶抗原，建立了由宿主免疫生物标志物分层诊断和寄生虫源性抗原-抗体对精准检测组成的双重研究框架。在宿主源性诊断生物标志物的研究中，多项高分辨率组学研究描绘了AE病变内独特的免疫细胞和分子表达特征。2025年发表的一项时空转录组学研究证实，Spp1⁺单核细胞源性巨噬细胞构成了AE病变中高度富集的病变特异性细胞亚群。这些细胞在健康肝组织中几乎检测不到，并且在早期囊型包虫病（CE）病变中也没有显著积累。该细胞亚群的原位空间分布模式有助于识别微小、隐匿的早期AE病变，并将活动性AE病变与正常肝组织区分开来。然而，SPP1作为宿主损伤和促纤维化反应的通用标志物，对AE缺乏绝对的疾病特异性。其上调可由一系列肝脏疾病触发，包括肝细胞癌、肝纤维化和晚期CE。因此，SPP1仅能作为原位组织检查的辅助鉴别标志物，不能单独用于AE的临床鉴别诊断或血清学检测。除了巨噬细胞相关生物标志物，对AE患者临床肝标本的单细胞RNA测序已验证，病变特异性耗竭的CD8⁺ T细胞、Th2细胞及其特征基因集（如Btg1、Nr4a1）与病变侵袭性和疾病活动性密切相关。这些特征可用于构建非侵入性分层诊断模型和术后复发监测系统，弥补了传统Em18血清学检测假阳性且无法评估疾病活动性的局限性。在开发特异性诊断试剂方面，单细胞组学能够高通量筛选多房棘球绦虫的保守性寄生虫特异性抗原，使其成为开发新型AE诊断抗体的关键前期技术。当前研究通过单细胞免疫谱分析已鉴定出高度特异性的寄生虫膜抗原如P29和EmCRT，并成功生成单克隆和多克隆抗体，可靠地消除了AE与CE之间的交叉反应性。使用这些抗体构建的ELISA平台和双模态成像探针在检测微小早期AE病变方面表现出优于经典Em18诊断试剂盒的灵敏度，为AE的高特异性血清学诊断和早期影像学诊断提供了新靶点和转化策略。

总之，通过单细胞谱鉴定的宿主免疫生物标志物主要应用于AE疾病分层和病变活动性评估，但特异性有限。相比之下，利用单细胞技术筛选的寄生虫源性抗原及匹配抗体对AE表现出高特异性，代表了未来开发精准AE诊断试剂盒的核心方向。

**2.4 棘球绦虫生长与宿主相互作用的机制**
近年来，研究人员利用单细胞测序构建了棘球绦虫细胞图谱，并首次分析了棘球绦虫原头节和生发层的细胞异质性。研究人员发现，特定的干细胞样亚群可能参与寄生虫的再生和囊泡形成。在棘球绦虫发育过程中，独特的细胞增殖模式依赖于未分化的生发细胞核心群体。这些细胞类似于在自由生活的扁形动物（如涡虫）中发现的多能新生细胞，被认为是寄生虫整个生命周期中唯一具有持续增殖能力的细胞。在多房棘球绦虫幼虫阶段，发育过程表现出显著的适应性。幼虫在中间宿主（如啮齿动物或人类）组织中以囊泡样结构侵袭性生长，并通过无性出芽生殖持续产生大量原头节。这种近乎无限的增殖潜能表明生发细胞具有干细胞样特性，包括全能分化（产生所有幼虫细胞类型）和长期自我更新以维持寄生虫在宿主中的增殖。

**2.4.1 sc-seq在探索AE生长与相互作用机制中的应用**
迄今为止，单细胞测序已应用于研究多房棘球绦虫（AE）的生长和发育，而针对细粒棘球绦虫（CE）的类似研究尚未开展。2022年，Xf Nian等人基于高通量转录组测序和微阵列技术，揭示了AE感染期间小鼠肝脏中lncRNA和mRNA的动态表达变化，并发现31个mRNA和68个lncRNA在整个感染时间线上持续失调。多房棘球绦虫在中间宿主肝脏中的生长、增殖和生存高度依赖于宿主免疫反应的复杂调控，揭示了lncRNA在调控AE宿主中Th细胞亚群分化中发挥潜在调节作用，并且Em感染在感染后第30天特异性激活两种先天免疫通路，Toll样受体和RIG-I样受体，Em感染过程伴随着宿主Th1/Th2/Th17免疫反应的动态失衡。转录组学研究有助于揭示调控RNA分子（特别是长链非编码RNA（lncRNA））在操纵宿主免疫反应以利于寄生虫生存中的潜在功能。作为一类重要的调控分子，lncRNA已被证实在多种感染（包括病毒、细菌和寄生虫）的宿主-病原体相互作用调控中发挥关键作用。2024年，Herz等人使用Illumina高通量测序技术对棘球蚴囊泡、生发细胞敲除组织和棘球蚴原代细胞培养物的互补脱氧核糖核酸（cDNA）进行了深度测序分析。经过严格的生物信息学分析，成功鉴定出一组约1180个基因，所有这些基因都与棘球绦虫生发细胞密切相关。这组基因不仅包括大量已知的干细胞标志物，还包含许多在细胞复制、细胞周期调控、有丝分裂、减数分裂、表观遗传修饰和核苷酸代谢等关键生物学过程中发挥重要作用的基因。特别地，鉴定出44个与干细胞相关的转录因子。根据现有研究和生物信息学预测，这些转录因子可能参与生发细胞的分化和调控，这对维持生发细胞多能性具有重要意义。

通过原位杂交和脉冲追踪实验，发现了一个值得注意的新发现，即鉴定了一种新的多功能棘球绦虫干细胞标志物EmCIP2Ah。同时，收集了充分的实验证据，证实了能够表达细胞外基质因子Emkal1的特殊慢循环干细胞亚群的存在。对原代细胞培养物的RNA测序分析显示，源自棘球绦虫细胞的干细胞表现出强大的分化能力。它们不仅能够分化成多种棘球绦虫特异性细胞类型，还能进一步分化成表达原头节、成虫和六钩蚴特异性基因的细胞。值得一提的是，该基因集还包括EmTRPMPZQ，这是血吸虫病吡喹酮靶标的同源物。最后，通过实验确定原代细胞培养物的一个特化细胞亚群能够表达肿瘤坏死因子α。进一步研究发现，添加哺乳动物肿瘤坏死因子α可显著加速生发细胞向棘球蚴囊泡的发育。总之，本研究利用多维度的实验和分析方法，对棘球绦虫生发细胞的转录组进行了全面深入的探索。这些发现不仅证实了源自棘球绦虫的干细胞具有强大的分化能力，也突显了原代生发细胞培养物在研究该寄生虫发育方面的巨大潜力。这些结果对于深入探索棘球绦虫干细胞在寄生虫发育过程中的作用机制具有重要理论价值，并为未来设计和开发能够特异性作用于寄生虫生发细胞的抗寄生虫药物提供了关键数据支持和理论基础。

**3 单细胞测序与空间转录组学在包虫病中的联合应用**
单细胞RNA测序能准确识别肝包虫病病变中的细胞身份、亚型和分子特征，但其存在空间信息丢失、肝脏和囊壁组织解离困难、细胞脱落、稀有细胞捕获率低以及明显的批次效应等问题。空间转录组学保留了完整的组织结构和空间位置，但缺乏单细胞分辨率和精细的细胞分型能力，在细胞鉴定和空间分析方面显示出高度互补性。将两种方法整合，首先通过scRNA-seq进行细胞聚类和注释，然后将注释的细胞特征映射到空间转录组学位点上，有效提高了研究的系统性和空间分辨率。该策略精确描绘了细胞亚群的空间分布，并进一步比较了囊型包虫病和泡型包虫病之间的局部免疫微环境，囊型包虫病具有完整的纤维性囊壁，免疫分布呈带状，免疫抑制微环境有利于寄生虫免疫逃逸；泡型包虫病呈现侵袭性模糊病变，从病灶中心到周围显示出慢性炎症、免疫紊乱和进行性纤维化的渐进梯度，为揭示肝包虫病的微环境异质性、病理进展和免疫逃逸机制提供了高维度证据。

2025年，Zhihua Ou等人在实验动物中使用了6至8周龄的雌性BALB/c小鼠。多房棘球绦虫原头节分离自青海玉树自然感染的青海田鼠，并通过小鼠腹腔传代维持。在活力鉴定和定量后，通过肝包膜联合腹腔注射将总共2000个原头节接种到小鼠体内。在感染后第4、8、15、37和79天多个时间点收集肝脏组织，同时建立空白阴性对照。收获的肝脏组织包埋于OCT中并低温保存，从而构建了覆盖不同感染病程的动物模型。

随后进行了一系列多组学测序和组织学验证。对OCT包埋样本进行RNA质量控制，仅采用RNA完整性数（RIN）≥7的样本进行后续实验。结合苏木精-伊红（H&E）染色，筛选含有感染病灶和相邻宿主组织的样本进行Stereo-seq。Stereo-seq文库的构建和测序在时空组学平台上完成，遵循标准程序，包括组织切片贴片、甲醇固定、透化、原位mRNA杂交、逆转录、cDNA扩增和上机测序。同时进行相邻组织切片的H&E染色用于病理评估。匹配的组织样本进行bulk RNA测序，涉及总RNA提取、浓度检测、文库构建和高通量测序，以获取组织的全局转录谱。靶向MPO和IL-1β的免疫组织化学（IHC）染色用于定位中性粒细胞并表征病变内的炎症表达。精确划定病灶周围和远病灶肝脏区域，制备单细胞悬液，并使用10x Genomics平台构建scRNA-seq文库，以实现肝细胞的高分辨率转录组谱分析。建立了标准化的多组学协作分析流程用于数据处理。原始Stereo-seq数据通过华大时空组学分析流程自动处理，包括条形码拆分、接头修剪、基因组比对、去冗余和基因定量。应用整合了小鼠基因组GRCm39和多房棘球绦虫基因组WBPS15的混合参考基因组。消除背景噪声，并采用bin100单元进行下游分析。使用Seurat包进行数据归一化、降维、聚类和空间可视化。结合H&E病理图像，确定寄生虫基因的分布和感染灶的范围。进行细胞类型反卷积以解析每个空间单元的细胞组成，并进行GSVA、基因特征评分、Pearson相关分析和基于CellChat的配体-受体相互作用分析，以探索不同空间区域中的免疫功能状态、细胞共定位和细胞间通讯。对于scRNA-seq数据，使用Cell Ranger进行条形码处理和基因表达矩阵生成。在Seurat中实施数据过滤、双细胞去除和整合。进行细胞聚类、细胞类型注释和差异表达基因筛选，同时进行GO功能富集、基因特征评估、NicheNet介导的配体调控网络分析和基于SCENIC的转录因子分析，以进一步揭示免疫细胞亚群的功能分化和分子调控机制。Bulk RNA-seq数据经过质量过滤、序列比对和表达归一化。进行主成分分析以表征整体转录特征，并采用CIBERSORTx反卷积解析免疫细胞组成，连接宏观转录变化与微观细胞异质性。

与单一测序技术的应用相比，结合scRNA-seq、Stereo-seq和bulk RNA-seq的整合策略呈现出突出的技术优势。作为一种无偏方法，scRNA-seq能够全面鉴定肝脏细胞亚群及其转录特征，精确定义中性粒细胞、Spp1⁺巨噬细胞和成纤维细胞等关键效应细胞的分子表型，然而它无法保留细胞的空间位置信息。相比之下，Stereo-seq可以原位描绘寄生虫病变、免疫浸润区域、纤维化区域和正常肝组织之间的转录差异，并动态可视化免疫细胞浸润、寄生虫-宿主相互作用和纤维化进展的空间模式，弥补了scRNA-seq细胞分辨率不足的缺陷。Bulk RNA-seq反映了组织的整体基因表达变化，并验证了疾病的时间转录特征，其反卷积分析将宏观表型变化与细胞组分变化联系起来。三种技术的协同整合使得能够从分子细胞学、空间分布和时间动态的角度多维解读肝泡型包虫病中免疫抑制、炎症失衡和病理纤维化的机制。还精确识别了病变微环境中的核心细胞相互作用热点和调控通路。同时，多组学数据之间的相互验证增强了研究结论的可靠性，并避免了单一技术研究对疾病机制的片面理解。该研究不仅为筛选时空特异性诊断生物标志物和开发靶向治疗策略提供了全面而坚实的理论依据，也为探索寄生虫感染性疾病的发病机制建立了可靠的多组学整合技术范式。

**讨论**
本综述聚焦于通过研究单细胞RNA测序在包虫病中的最新进展，来制定下一步研究策略，以发现新的生物学靶点并为该病的分子靶向治疗做出贡献。包虫病是一种由棘球绦虫幼虫感染引起的人兽共患病。其致病机制复杂，涉及宿主免疫反应与寄生虫逃逸之间的长期相互作用。近年来，单细胞测序技术已广泛应用于包虫病研究，以阐明宿主免疫微环境中免疫细胞的异质性，从而揭示感染部位（如肝脏）中宿主免疫细胞（巨噬细胞、T细胞、B细胞等）的亚群分化和功能状态，系统分析免疫抑制机制，并通过评估感染宿主中调节性T细胞和髓系抑制细胞的动态变化，确定包虫病可能通过分泌外泌体或特定代谢产物重塑免疫微环境并抑制Th1/Th17免疫反应。构建了寄生虫细胞图谱，并首次分析了棘球绦虫原头节和生发层的细胞异质性。鉴定出特定的干细胞样亚群参与寄生虫的再生和囊泡形成。通过比较感染患者与健康人外周血单个核细胞的转录组差异，观察到CD8⁺ T细胞中特定趋化因子的表达水平以及外周循环中游离棘球绦虫DNA可作为新的潜在诊断标志物。探索新的药物靶点，鉴定寄生虫生发层特异性高表达基因作为新型药物靶点，结合CRISPR筛选验证化疗潜力，为包虫病机制研究和治疗开发提供了创新策略。这些研究为下一步分子靶点筛选和验证实验提供了一些参考数据。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）具有突出优势：解析细胞异质性，避免bulk RNA-seq的平均偏差，构建高分辨率单细胞转录组图谱，通过伪时间分析重建细胞分化和病理轨迹。它精确表征免疫微环境，适应小型临床样本，能够深入探索肝包虫病中的细胞亚型、基因表达和宿主-寄生虫相互作用。然而，scRNA-seq在该疾病研究中存在系统性局限性。肝组织和囊壁的致密结构，富含纤维化、钙化和粘液基质，给组织解离带来很大困难，容易导致细胞损伤、凋亡和细胞活力低下。解离过程中严重的细胞脱落导致原位细胞组分丢失，同时稀有细胞亚群的捕获效率低，未能充分富集关键的稀有免疫和病灶细胞。来自样本、试剂和测序平台的明显批次效应引入了系统性偏差，降低了数据可重复性。此外，宿主和寄生虫RNA的严重失衡使得占优势的宿主转录本掩盖了低丰度的寄生虫RNA，导致基因组比对和物种注释不准确。固有的技术缺陷包括有限的基因捕获效率、低频基因的频繁丢失事件、扩增噪声、高成本，以及仅3'端测序无法分析全长转录本。此外，组织解离完全丢失了空间信息，并忽略了病变的强烈空间异质性；scRNA-seq主要关注mRNA，缺乏对非编码RNA和表观遗传调控的覆盖，仅提供静态的转录快照，而非动态的细胞通讯。同时，缺乏成熟的细胞系和类器官模型阻碍了对测序筛选出的关键基因和细胞亚群的功能验证。总之，尽管scRNA-seq为研究肝包虫病中的细胞异质性、免疫微环境和宿主-寄生虫相互作用提供了高分辨率支持，但它受到肝脏和囊壁组织解离困难、细胞脱落、稀有细胞亚群捕获率低、批次效应和宿主-寄生虫RNA失衡等不可避免的问题以及技术和解释瓶颈的限制。需要结合空间转录组学、多组学策略、优化的解离方案和动物模型来弥补这些不足，并进一步阐明发病机制，鉴定肝包虫病的诊断和治疗靶点。

**结论与展望**
目前，单细胞测序正在将包虫病研究推进到细胞和分子水平，有望在未来通过技术创新和跨学科合作在发病机制、精准医学和疫苗开发方面取得突破。然而，该技术存在一些局限性，在样本制备、数据分析和临床转化方面仍存在挑战。未来，可以依赖更新、更具优势的单细胞全长测序和空间转录组测