《Frontiers in Immunology》：Developmental expression of immune-associated secreted novel AID/APOBEC-like deaminases (SNAD1s) in common carp (Cyprinus carpio)
编辑推荐：
硬骨鱼类的早期发育阶段是生命周期中的脆弱期，其特征为暴露于波动的非生物和生物环境条件下。免疫系统成熟是一个渐进过程，始于依赖母体转移的免疫因子，随后先天免疫系统被激活，最终建立适应性免疫。近期在鲤（Cyprinus carpio）中的研究鉴定出一个称为分泌型新
硬骨鱼类的早期发育阶段是生命周期中的脆弱期，其特征为暴露于波动的非生物和生物环境条件下。免疫系统成熟是一个渐进过程，始于依赖母体转移的免疫因子，随后先天免疫系统被激活，最终建立适应性免疫。近期在鲤（Cyprinus carpio）中的研究鉴定出一个称为分泌型新型AID/APOBEC样脱氨酶（Secreted Novel AID/APOBEC-like Deaminases, SNAD1s）的细胞苷脱氨酶新家族。尽管其生物学功能尚不清楚，但初步证据表明snad1基因可能参与免疫及应激相关过程。在本研究中，研究人员分析了13个snad1基因在鲤胚胎和早期仔鱼发育过程中的表达。除snad_506外的12个基因表现出显著的阶段依赖性表达变异，并形成四种不同的时间表达模式。四个旁系同源基因（snad_318、snad_800、snad_835和snad_810）为母本表达，提示其沉积于卵母细胞中并可能参与早期发育调控。相比之下，snad_409、snad_208和snad_962显示延迟的合子后激活，在后期发育阶段观察到表达增加，这与孵化后免疫相关生理过程的成熟及宿主防御机制的建立相吻合。对公开RNA-seq数据集的比较分析证实了snad1表达动态在不同研究和方法学间的保守性。本研究首次全面概述了脊椎动物个体发生过程中发育期的snad1基因表达。snad1基因的动态及阶段依赖性表达揭示了不同的发育调控模式，并突显了鲤snad1基因家族在个体发生期间的显著异质性。
论文发表在《Frontiers in Immunology》。硬骨鱼类早期发育阶段高度易受环境波动与微生物暴露影响，孵化后胚胎与仔鱼直接暴露于水温、水质等非生物胁迫及病原微生物中，气候变迁加剧此挑战致早期高死亡率，成为现代水产养殖瓶颈。保护初期依赖母体转移免疫球蛋白与先天效应分子等免疫因子，自体免疫能力随个体发生逐步建立，合子基因组在母本向合子转换（maternal-to-zygotic transition, MZT）期激活启动先天免疫相关基因表达，鲤适应性免疫需受精后1至2个月完全建立，理解免疫机制个体发生对鱼类免疫学基础与水产业防护具重要意义。激活诱导胞苷脱氨酶/载脂蛋白B mRNA编辑催化多肽样脱氨酶（Activation-induced cytidine deaminase/apolipoprotein B mRNA editing catalytic polypeptide-like deaminases, AID/APOBECs; AADs）为锌依赖脱氨酶催化核酸碱基脱氨致胞苷转尿苷，调控先天与适应性免疫反应。2018年系统发育分析揭示具信号肽的分泌型新型AID/APOBEC样脱氨酶（Secreted Novel AID/APOBEC-like Deaminases, SNAD1s）区别于经典胞内AADs，snad1基因仅存于低等变温脊椎动物如鱼类，实验室首证鲤血浆冷驯化中存SNAD_810蛋白。虽SNAD1蛋白生物学功能大多未知，累积证据示其涉免疫与应激响应，近期研究表征SNAD1家族系统发育与结构多样性并重注释未表征鱼蛋白与转录本为SNAD1同源物，比较分析示鱼类间SNAD1序列广泛保守，其在先天与适应性免疫反应、冷增强免疫及应激过程中表达显著调制，斑马鱼仔鱼数据支持snad1基因在早期脊椎动物发育中保守作用。鲤为全球重要淡水养殖种及互补斑马鱼之脊椎动物模型，因体外发育与持续暴露于富微生物水生环境，鲤胚胎仔鱼早期个体发生高度依赖先天防御机制，鉴于SNAD1蛋白关联鱼免疫过程之新兴证据，理解其发育调控可为早期宿主防御分子基础提供重要见解。近期分析鉴定鲤基因组中13个snad1基因，突显该家族意外扩张及需全面评估发育期表达动态之必要，鲤snad1旁系同源基因异常多或关联鲤科基因组复杂演化史包括鲤谱系额外全基因组复制，确切扩张机制未明。因此研究人员旨在表征全部13个已知snad1基因在鲤胚胎发生全程之表达谱，利用多重PCR分析受精至孵化关键发育阶段即0、17、26、49、74、98、123、147、170、190及240小时受精后（hours post fertilization, hpf）转录丰度，揭示snad1家族成员间不同时间表达模式示早期个体发生差异调控及潜在贡献于免疫能力建立，据知本研究首次全面分析脊椎动物发育中snad1基因表达并建立此新型分泌型胞苷脱氨酶家族未来功能研究框架。
研究人员采用的主要关键技术方法如下。实验用BV镜鲤亲鱼取自南波希米亚大学渔业与水域保护学院池塘，雌雄分开饲养管理并于五月转移至孵化场诱导产卵，采用鲤垂体提取物（carp pituitary extract, CPE）注射催产，21摄氏度下Zugar瓶孵化受精卵。取样涵盖0至240 hpf共11个发育阶段，每阶段自同批受精混合后代取四独立生物学重复样本提取RNA。基因表达分析靶为13个snad1基因，引物用Pyrosequencing Assay Design软件设计跨外显子 exon-exon 连接防基因组DNA扩增并验证。采用Fluidigm Gene Expression生物芯片集成流体电路（integrated fluidic circuit, IFC）技术与BioMark HD系统进行多重定量PCR（multiplex quantitative PCR），cDNA合成后预扩增，全局均值归一化（global mean normalization）处理数据。统计用Shapiro-Wilk验正态性、Brown-Forsythe验方差齐性，单因素ANOVA与Tukey事后检验，层次聚类用Ward联结法与欧氏距离定六簇。
3 Results
3.1 Snad1s expression dynamics during carp ontogeny
结果显示除snad_506外12个snad1基因表达在发育阶段间显著差异。snad_800与snad_318在26至74 hpf显著上调，123 hpf起二次显著上调至147 hpf达峰值并维持；snad_063相似但123 hpf后次级增加较不明显；snad_835与snad_160在26至74 hpf早期增加但123 hpf后下降147 hpf降幅最大；snad_810、snad_769、snad_448、snad_946在26至74 hpf增加后后期稳定无大幅波动；snad_409、snad_208、snad_962至123 hpf前近零极低水平，之后迅速显著增加。snad_318、snad_810、snad_835在0 hpf已较高表达，其余多数在受精首小时内可检测，示母本来源；snad_409等无受精时转录本仅合子基因组激活（zygotic genome activation, ZGA）后增加示严格合子来源。据此识出四种时间表达模式：具早期后胚胎上调伴幼虫期持续表达之模式一含snad_800、snad_318、snad_063；早期增加后74 hpf后稳定无二次上调之模式二含snad_810、snad_769、snad_448、snad_946；早期类似模式一但123 hpf显著下降之模式三含snad_835、snad_160；及123 hpf后延迟显著上调之模式四含snad_409、snad_208、snad_962。
3.2 Hierarchical cluster analysis
层次聚类析所有snad1基因表达谱，据树状图联距阈值7.5定六簇。簇1仅snad_506，簇2仅snad_962，簇3含snad_318与snad_800，簇4含snad_409与snad_208，簇5含snad_160与snad_835，簇6含snad_810、snad_063、snad_769、snad_448、snad_946。示多基因簇具相似时间表达谱暗示协调转录调控与部分保守机制及潜在功能关系，单基因簇示表达动态异于其余旁系同源。
讨论部分总结如下。本研究首次揭示鲤早期个体发生中snad1基因表达，13个snad1基因均表达，除snad_506外12个呈显著阶段依赖性变异，层次聚类分六簇。发育表达谱示12个旁系同源在鲤早期个体发生具显著时间异质性暗示功能多样化，四种时间表达模式对应关键发育阶段并紧密关联免疫与应激过程。snad_506无显著发育变异表达稳定，生物学意义不明或示家族内功能分歧。多基因在0 hpf或首小时内可检测转录本强示母本沉积，因鲤约20摄氏度下ZGA于早囊胚约3至5至7至8 hpf，此前依赖母本mRNA调控胚胎发生；snad_409等无母本转录本仅ZGA后增示严格合子起源。模式一早期上调持续关联晚期器官发生、先天免疫起始、胸腺发育与适应性免疫形成及孵化转外源营养；模式二持续稳定示连续转录需求；模式三双相早期升后降示早期免疫相关过程后后期减少活性或功能特化；模式四延迟表达增与孵化后免疫生理成熟及宿主防御建立吻合。四模式分早诱导持续激活、早诱导后抑制与晚诱导突显snad1家族功能异质性，其激活与免疫系统建立等关键转换紧密时间关联为未来功能研究候选。聚类示snad_506与snad_962独立单基因簇，多基因簇示相似时间表达谱选定性协调转录调控，snad1旁系同源异质性中存在子集保守时间表达模式并与免疫能力建立期重合。再分析Luo等人公开RNA-seq数据集（koi carp, Cyprinus carpio var. koi）独立确认13个snad1基因在胚胎早期仔鱼发育表达，虽取样与设计及RNA-seq与多重PCR方法差异限直接定量比，但数据集一致性强支持snad1基因早期胚胎发生时间表达及鲤谱系间个体发生与免疫成熟中进化保守角色。结论部分翻译如下：本研究首次全面表征鲤（Cyprinus carpio）早期个体发生中全部13个snad1基因表达动态。所得结果示snad1旁系同源自最早发育阶段转录活跃并显不同时间表达谱。若干snad1基因受精时已表达，暗示母本起源及潜在参与早期胚胎发生，而其他于后期激活与先天及适应性免疫功能发育及转外源摄食吻合。分析识出四种主要时间表达模式包括早诱导持续激活、早诱导后抑制及晚诱导，以及六不同层次表达簇，突显snad1基因家族内显著功能异质性。同时观察选定性旁系同源共表达暗示鲤个体发生中运作之部分保守调控机制存在。值得注意的是这些表达谱时间分布密切平行关键发育转换包括早期生活阶段免疫系统形成关联期。与koi carp公开RNA-seq数据集比较进一步确认snad1基因在Cyprinus谱系间发育表达保守，加强SNAD1家族成员在早期脊椎动物发育中扮演进化保守角色之假说。综上研究发现示SNAD1蛋白代表AID/APOBEC样胞苷脱氨酶家族之硬骨鱼特异性扩张具潜在多样化生物学功能。个别snad1旁系同源观察之不同时间表达轨迹示个体发生功能多样化，而其于免疫系统成熟期间协调激活指向潜在贡献于早期免疫能力发展。未来研究应聚焦鉴定分子靶标、调控路径及个别snad1旁系同源功能特化以更好理解其对鱼免疫、胚胎发育与环境适应之贡献。
