《Journal of Autoimmunity》：Targeting autoreactive B cells in rheumatoid arthritis through MHC class I-presented BCR-derived neo-epitopes
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体细胞突变（somatic mutations）可以产生被CD8+ T细胞（CD8+ T cells）识别的新抗原（neoantigens），从而实现对突变细胞的靶向清除。目前针对人类B细胞介导的自身免疫性疾病的已建立的B细胞靶向疗法缺乏特异性，且未能实现持久
体细胞突变（somatic mutations）可以产生被CD8+ T细胞（CD8+ T cells）识别的新抗原（neoantigens），从而实现对突变细胞的靶向清除。目前针对人类B细胞介导的自身免疫性疾病的已建立的B细胞靶向疗法缺乏特异性，且未能实现持久缓解。由于自身反应性B细胞通常表达经过广泛体细胞高度突变（somatic hypermutation, SHM）的B细胞受体（B cell receptors, BCRs），研究人员假设可以利用突变的BCR来源的新抗原（neoantigens）来选择性靶向这些自身反应性B细胞。然而，关于自身反应性BCR来源的新抗原表位（neoepitopes）的鉴定、验证以及它们被呈递和具有免疫原性的程度仍知之甚少。在本研究中，研究人员调查了产生抗瓜氨酸蛋白抗体（anti-citrullinated protein antibodies, ACPAs）——类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）的标志性抗体应答——的自身反应性B细胞的免疫靶向可能性。通过结合计算机模拟MHC I类（MHC class I）结合分析、肽洗脱质谱（peptide-elution mass spectrometry）和CD8+ T细胞激活实验（CD8+ T cell-activation assays）的综合方法，研究人员研究了9种常见的HLA I类（HLA class I）等位基因和150个来自患者的BCR序列。研究结果预测，所有自身反应性BCR都含有至少能被3种HLA I类等位基因呈递的序列。值得注意的是，这些序列中有85%含有SHM，这些突变引入了与新抗原表位候选物相容的氨基酸变化。对三个BCR转导细胞系中HLA I类洗脱肽的质谱分析证实了多个预测的新抗原表位的存在，并揭示了额外的未预测到的BCR来源肽。重要的是，其中几个新抗原表位被内源性加工、呈递，并被原代人CD8+ T细胞识别，而它们的未突变对应物未被同一CD8+ T细胞克隆识别。这些发现强调，一种结合MHC分离、肽鉴定和BCR测序的综合策略，可作为揭示人类主要自身免疫性疾病中自身反应性B细胞所呈递新抗原的有力平台。同样，它们揭示了一种特异性靶向自身反应性B细胞的新方法，为RA以及其他潜在的B细胞驱动的自身免疫性疾病的个性化免疫治疗干预铺平了道路。
**论文解读文章**
**研究背景、问题与目的**
自身免疫性疾病影响全球约10%的人口，其中约80%为女性，且发病率随年龄增长而增加。尽管过去二十年治疗取得了显著进展，但多数自身免疫性疾病仍无法治愈，患者常需终身药物治疗，造成巨大的公共卫生和社会经济负担。B细胞失调是类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis, RA）等多种自身免疫性疾病的关键病理特征，表现为疾病特异性自身抗体的产生，这些抗体常与疾病活动性和进展相关。目前基于B细胞靶向的单克隆抗体疗法（如CD20抗体）和CD19嵌合抗原受体T细胞（CAR T细胞）疗法在部分患者中有效，但缺乏对自身反应性B细胞的特异性，且难以实现持久缓解。因此，开发更精准的靶向策略至关重要。
在肿瘤领域，体细胞突变（somatic mutations）可产生被CD8+ T细胞（CD8+ T cells）识别的新抗原（neoantigens），通过免疫检查点阻断或新抗原疫苗可有效清除肿瘤细胞。这一概念提示，在自身免疫性疾病中，可能利用类似机制靶向携带体细胞高度突变（somatic hypermutation, SHM）的自身反应性B细胞。RA患者中，抗瓜氨酸蛋白抗体（anti-citrullinated protein antibodies, ACPAs）阳性B细胞经历了广泛的SHM，平均重链和轻链分别有52个和25个核苷酸突变，约75%为非沉默氨基酸改变。这些突变可能产生BCR（B细胞受体）来源的新抗原表位（neoepitopes），被MHC I类（MHC class I）分子呈递并被CD8+ T细胞识别。然而，目前尚不清楚这些新抗原表位是否确实被加工、呈递并具有免疫原性。本研究旨在系统性地验证这一假设，为RA患者开发基于新抗原的个性化免疫治疗提供概念验证。
**研究内容与结论**
研究人员采用整合方法，结合计算机模拟MHC I类结合预测（NetMHCpan 4.1）、肽洗脱质谱（peptide-elution mass spectrometry）和CD8+ T细胞激活实验，分析了150个来自RA患者的ACPA阳性BCR序列和9种常见HLA I类等位基因（HLA-A?01:01, A?02:01, A?03:01, A?11:01, A?24:02, B?07:02, B?08:01, B?15:02, B?35:01）。研究得出以下结论：所有自身反应性BCR均有至少3种HLA I类等位基因的预测结合肽；85%的预测结合肽包含至少一个体细胞突变，构成候选新抗原表位；通过质谱分析在K562和Ramos细胞系中证实了多个BCR来源新抗原表位的内源性加工和呈递；从健康供体外周血中分离出BCR新抗原表位特异性CD8+ T细胞克隆，这些克隆能识别内源性呈递的突变肽，但不识别其未突变的种系对应物。该研究发表在《Journal of Autoimmunity》。
**关键技术方法**
1. **计算机模拟预测**：使用NetMHCpan 4.1对150个ACPA阳性BCR重链可变区序列的8-11mer肽进行9种常见HLA I类等位基因的结合亲和力预测。
2. **HLA肽组学实验**：通过免疫亲和层析从BCR转导的K562细胞系（表达HLA-A?02:01、B?07:02或A?03:01）和Ramos B细胞系（内源性HLA-A?03:01等）中洗脱HLA I类结合肽，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析鉴定肽序列。
3. **CD8+ T细胞克隆分离与功能检测**：使用pHLA四聚体从HLA匹配的健康供体PBMCs中富集BCR肽特异性CD8+ T细胞，单细胞分选后扩增，通过IFN-γ酶联免疫吸附试验（ELISA）评估其对肽脉冲细胞或BCR转导细胞系的反应性。
4. **样本来源**：RA患者ACPA阳性BCR序列来自荷兰莱顿大学医学中心（LUMC）伦理委员会批准的既往研究；健康供体血样来自Sanquin血库。
**研究结果**
**3.1 大多数ACPA BCR预测在常见HLA I类分子中呈递新抗原表位**
通过计算机模拟预测，150个ACPA BCR序列中平均93.7%（范围79.5-100%）至少有一个弱或强结合肽能结合至9种HLA I类等位基因中的至少一种；60.7%的序列能结合所有9种等位基因。85.5%的预测结合肽含有至少一个体细胞突变，定义为新抗原表位候选物；这些肽主要位于框架区3，但也分布于其他区域。
**3.2 BCR来源新抗原表位在工程化K562细胞中被天然加工和呈递**
构建表达HLA-A?02:01和B?07:02的K562细胞系，并转导三个患者来源的ACPA BCR（2G9, 3F3, 7E4）。通过免疫沉淀和质谱分析，鉴定出14个HLA配体，包括9个独特肽核心及其长度变体。与NetMHC预测相比，部分洗脱肽未被预测，包括预测肽的长度变体和预测排名不在前2%的肽。所有洗脱的预测肽均含有体细胞突变。
**3.3 BCR来源新抗原表位呈递在生理相关的B细胞系中得以保留**
采用Bcl-6/Bcl-xL永生化的RA患者ACPA表达B细胞系（RA1003.4），但初始质谱分析未检测到BCR可变区肽。随后在K562细胞中表达RA1003.4 BCR及相关HLA等位基因，鉴定出5个RA1003.4来源肽，但靶向平行反应监测（PRM）仍无法在RA1003.4细胞系中检测到这些肽。改用Ramos B细胞系（敲除内源性IGHM/IGHD/IGLC及AID）表达相同BCR，并聚焦于HLA-A?03:01，洗脱出2个HLA-A?03:01限制性肽、1个HLA-B?51:01肽和2个HLA-C?16:01长度变体。在K562-A?03:01细胞中仅重复出1个HLA-A?03:01肽，且该肽是NetMHC预测的唯一非amer。
**3.4 BCR来源新抗原表位反应性CD8+ T细胞存在于健康个体循环中**
基于HLA-A?02:01和B?07:02的确认配体，制备pHLA四聚体，从15名HLA匹配健康供体PBMCs中分选并扩增出1016个四聚体阳性CD8+ T细胞克隆，其中84个对至少一种肽有反应。8个克隆能识别BCR转导K562细胞系天然加工呈递的肽，而不识别种系回变肽。这些克隆的亲和力存在差异，且部分克隆可同时识别长度变体。
**3.5 CD8+ T细胞克隆在人类Ramos B细胞中识别BCR来源新抗原表位**
将HLA-A?02:01引入Ramos细胞，表达2G9或7E4 BCR。5个AMDPSKNQV特异性克隆中有4个在共培养时产生IFN-γ，其中最高亲和力克隆（7aB6）强识别Ramos细胞内源性呈递的2G9新抗原表位。HLA-A?03:01限制性克隆虽能分离，但对内源性肽的识别有限，无法进一步分析。
**讨论与结论**
本研究提供了多条证据支持体细胞突变的BCR可作为CD8+ T细胞靶向清除自身反应性B细胞的靶点：计算机模拟预测广泛的新抗原表位呈递可能，实验确证内源性加工和呈递，以及从健康供体初始CD8+ T细胞库中成功分离出功能性特异性克隆。这些T细胞不识别种系对应物，表明中枢耐受未消除对体细胞突变肽的反应性。未来关键问题在于患者体内是否同时存在BCR新抗原表位及其特异性CD8+ T细胞，以及是否可通过疫苗诱导激活。研究还指出，ACPA表达B细胞库的寡克隆性为靶向优势克隆的个性化多价疫苗策略提供了可能。尽管存在B细胞库广度、耐受机制等潜在瓶颈，但该研究为基于新抗原的精准免疫治疗奠定了基础，尤其适用于RA及其他BCR库相对受限的自身免疫性疾病（如疫苗诱导免疫性血栓性血小板减少症VITT或多发性硬化MS）。**结论**：总之，这些发现建立了一种基于体细胞突变BCR序列精准靶向自身反应性B细胞的新范式。研究人员已证明，BCR来源新抗原表位可被HLA I类分子加工和呈递，并能被功能性CD8+ T细胞识别，为自身免疫性疾病中一种全新的治疗方法提供了概念验证。ACPA表达B细胞的高突变负荷和广泛的预测HLA呈递性表明，该方法适用于大部分RA患者。除了RA，该方法对BCR库更受限的自身免疫性疾病（如VITT或MS）尤其有前景。总体而言，本研究为开发能选择性清除人类自身反应性B细胞同时保留保护性免疫库的个性化新抗原疗法提供了概念框架和方法平台。
