整合血浆至空间蛋白质组学揭示乳腺癌肝转移中成纤维细胞相关特征

《Cancer Cell International》：Integrative plasma-to-spatial proteomics reveals fibroblast-associated signatures in liver metastatic breast cancer

　　

摘要

背景
乳腺癌肝转移（BCLM）与侵袭性疾病过程及较差生存结局相关。基于放射的肝脏定向局部区域治疗（LRT）受到耐药与复发的限制。尽管液体活检能够实现全身性监测，但其对肿瘤微环境（TME）的洞察及对耐药机制的解析能力有限。在这项以假设生成为目的的研究中，研究人员联合应用高通量血浆蛋白质组学与配对肿瘤组织的数字空间蛋白分析，旨在建立系统性信号与局部肿瘤生物学之间的联系，从而阐明治疗应答的潜在机制。

方法
研究人员纳入接受局部区域治疗（LRT）的乳腺癌肝转移（BCLM）患者（n?=?14）的血浆与组织样本。采用高通量蛋白质组学分析平台（Olink Proteomics，瑞典乌普萨拉）检测并定量血浆循环蛋白。获取治疗前配对组织样本，并利用数字空间蛋白分析（Digital Spatial Profiling，DSP；GeoMX，NanoString Technologies，美国西雅图）评估特定组织分区内的蛋白表达。随后将结果与临床结局进行相关分析。

结果
系统性蛋白质组学分析显示，未生存者在治疗前存在显著升高的CD8A、CX3CL1和FGF-21水平，提示一种高激活但无效的免疫状态。相较之下，生存者表现为血浆MMP1升高（p?=?0.035，AUC?=?0.896），同时肿瘤内MMP1水平降低。空间分析未发现肿瘤微环境（TME）内免疫细胞信号分布存在显著差异。然而，分区特异性分析揭示了关键模式：免疫间质中的Ki-67而非肿瘤细胞中的Ki-67与治疗应答相关；与此同时，未生存者肿瘤上皮细胞中的纤连蛋白（Fibronectin）和α-SMA异常富集。这些发现与一种间质样特征（mesenchymal-like signature）及不良生存相关，并提示上皮性纤连蛋白可作为值得进一步研究的候选生物标志物。

结论
整合血浆蛋白质组学与空间蛋白质组学可揭示乳腺癌肝转移（BCLM）对局部区域治疗（LRT）耐药的关键机制，其中MMP1与纤连蛋白在血液和肿瘤中的作用方向相反。与肿瘤上皮区室相关的癌症相关成纤维细胞（CAFs）可能构成未来研究的潜在靶点，尤其可围绕MMP1抑制进行探索，并有望作为放射治疗的辅助干预策略。

该文发表于《Cancer Cell International》，围绕乳腺癌肝转移（breast cancer liver metastases，BCLM）接受放射性肝脏局部区域治疗（locoregional therapies，LRT）后的疗效差异与耐药机制展开。研究背景在于，乳腺癌远处转移是患者死亡的主要原因之一，而肝转移提示疾病侵袭性强、预后差。尽管高剂量率近距离放疗（high-dose rate brachytherapy，HDR-BT）和选择性内放射治疗（selective internal radiation therapy，SIRT）等肝定向治疗近年来因局部控制效果和安全性受到重视，但仍有相当比例患者出现复发或进展。现有液体活检方法虽可实现微创、动态的系统监测，但难以揭示肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中的空间异质性和局部耐药过程。因此，如何把血液中的系统性分子信号与肿瘤组织内的局部蛋白表达相衔接，成为理解治疗应答差异的关键问题。

基于这一问题，研究人员开展了一项探索性、假设生成性研究，对14例接受放射性LRT的BCLM患者进行血浆—组织整合蛋白质组学分析。研究以24个月总生存期（overall survival，OS）为界，将患者划分为生存者与未生存者，并比较两组在治疗前后血浆循环蛋白谱及治疗前配对肿瘤组织空间蛋白表达上的差异。研究结果表明，未生存者在治疗前即呈现出高激活但可能功能低效的全身免疫状态，而生存者则表现出不同的基质重塑相关信号。尤其重要的是，研究通过空间分区分析发现，未生存者肿瘤上皮区室内纤连蛋白（Fibronectin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）异常富集，提示癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）或间质化表型与不良结局密切相关。文章的重要意义在于，研究人员提出了将血浆蛋白质组学与数字空间蛋白分析联合使用的研究框架，用以解析BCLM对放射性LRT的潜在耐药机制，并为筛选预后标志物及后续联合治疗靶点提供依据。

在技术方法上，研究样本来源于LMU Hospital接受放射性局部治疗的乳腺癌肝转移患者亚组。研究人员采集治疗前基线及治疗后48 h外周血，采用Olink Target 96 Immuno-Oncology与Inflammation面板，基于邻近延伸分析（Proximity Extension Assay，PEA）进行高通量血浆蛋白检测。治疗前肝转移组织石蜡样本接受GeoMX数字空间蛋白分析（Digital Spatial Profiling，DSP），在PanCK、CD45、CD68等标记辅助下分割上皮区室与免疫-间质区室，并用49重蛋白面板进行定量。另以免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）验证MMP1与FAP表达，并结合ROC、Kaplan-Meier及单因素Cox分析评价蛋白与生存结局的关系。

以下为论文结果部分的分标题解读。

一、Patients’ characteristics and survival
研究共纳入14例BCLM患者，其中6例按24个月OS标准归为生存者，8例归为未生存者。患者中6例接受HDR-BT，8例接受SIRT；生存结局在不同治疗方式间分布不均，HDR-BT组生存者较多，SIRT组未生存者较多。研究人员明确指出，鉴于样本量有限，这种分布差异需谨慎解读，相关分析主要具有探索性质。

二、Longitudinal proteomics analysis of plasma samples differentiates survivors from non-survivors
研究人员首先对治疗前基线血浆进行差异蛋白分析。结果显示，共有12种蛋白在两组间存在显著差异。未生存者中11种蛋白升高，包括IL-15RA、TNFRSF4、TNFRSF9、GDNF、CD8A、CX3CL1、FGF-21、CRTAM、KLRD1、CD5和TRAIL。这些蛋白多与T细胞/NK细胞活化、细胞因子信号或促肿瘤微环境相关。相反，MMP1是唯一在生存者中升高的蛋白。治疗后血浆分析显示，生存者中MMP1、Axin1、TRANCE和IL-1α仍较高，而未生存者中CD8A、LIF、IL-13、DCN和PTN较高，提示治疗后两组仍维持不同的系统性生物学状态。Kaplan-Meier分析进一步显示，较高的CRTAM、KLRD1、FGF-21、CX3CL1、CD8A等水平与较短OS相关，而较高MMP1与较长OS相关。单因素Cox分析支持MMP1、CRTAM、KLRD1、FGF-21、CX3CL1和CD8A与OS存在显著关联。由此可见，血浆蛋白组在治疗前后均可区分预后不同的患者，并指向免疫激活失衡与基质重塑并存的耐药图景。

三、Immune cell infiltration in metastatic breast cancer patients and survival
为验证血浆信号并明确其组织学背景，研究人员对治疗前肿瘤样本进行DSP分析，首先观察整体免疫细胞浸润情况，包括CD4⁺辅助性T细胞、CD8⁺细胞毒性T细胞、FoxP3⁺调节性T细胞、CD68⁺巨噬细胞、CD163⁺/ARG1⁺M2型巨噬细胞、CD80⁺M1型巨噬细胞及CD66b⁺中性粒细胞。结果显示，在不区分区室的情况下，生存者与未生存者之间各类免疫细胞丰度均无显著差异。这说明单纯的免疫细胞数量并不能解释疗效差异，也提示更精细的空间分区分析是必要的。

四、ROIs selection and protein quantification in separate compartments
随后，研究人员在肿瘤及邻近组织中选取40个感兴趣区域（region of interest，ROI），进一步划分出120个照明分析区（area of illumination，AOI），分别对应PanCK阳性的上皮/肿瘤区室和PanCK阴性的免疫-间质区室。主成分分析（PCA）及无监督层次聚类显示，上皮区室与免疫-间质区室在整体蛋白表达上明显分离，免疫-间质区室富集更多免疫相关蛋白，说明空间分割策略具有良好有效性。这一部分建立了后续区室特异性比较的分析基础。

五、Protein distribution in the epithelial and immune-stroma compartments
在区室分层后，研究人员发现未生存者的上皮区室中纤连蛋白与α-SMA显著升高。进一步生存分析表明，上皮区室纤连蛋白升高与较短OS相关，其AUC为0.771，危险比（HR）为5.184，提示其具有潜在不良预后价值。与此相对，纤连蛋白在免疫区室中并无显著表达差异；免疫-间质区室中则表现为Ki-67升高，且与治疗应答相关。相关性分析显示，纤连蛋白与α-SMA均与CK表达正相关，而与CD45无显著相关，支持它们主要定位于上皮区室而非白细胞富集区。该结果提示，不良预后患者的肿瘤上皮区室具有更显著的成纤维细胞相关或间质样重塑特征，这可能是血浆系统性信号的局部来源之一。

六、Expression of MMP1 in tumor as a marker of CAFs
基于血浆分析中MMP1在生存者中升高这一现象，研究人员进一步用IHC检测肿瘤组织中的MMP1及成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein，FAP）。结果显示，未生存者肿瘤内MMP1表达更高，且主要见于肿瘤区域；生存者则仅见极少或可忽略的内皮细胞染色。在相近组织区域中，未生存者还表现出更高的FAP表达，支持CAFs富集的判断。这一结果揭示了MMP1在血液与肿瘤局部中的方向相反现象：循环MMP1升高与较好生存相关，而肿瘤内MMP1升高则见于预后较差者。研究人员据此指出，系统性MMP1信号与局部肿瘤MMP1可能反映不同生物学背景。

七、Correlation between Fibronectin/α-SMA expression in the epithelial compartment and fibroblast-related systemic cytokines
研究人员进一步评估局部上皮区室中的纤连蛋白/α-SMA是否与全身CAF相关细胞因子谱相一致。基线时，IL22-RA1、CX3CL1、IL-1α、CXCL9、TGF-α和IL-4与纤连蛋白或α-SMA呈显著正相关；治疗后，IL22-RA1、CX3CL1、IL-13、ANGPT2、CXCL5和IL-4也与之显著相关。该结果说明，局部成纤维细胞相关表型可能与全身循环细胞因子网络相互呼应。不过作者同时强调，受限于样本量，这些相关性结论仅具假设生成意义。

在讨论部分，文章强调肝脏本身具有免疫耐受性微环境，这可能影响肝转移灶对放疗的反应。整合血浆与空间蛋白质组学后，研究人员认为，未生存者虽然呈现多种免疫激活相关蛋白升高，但这种激活可能是慢性刺激、功能衰竭或促肿瘤环境中的无效免疫反应；与之相对，生存者的循环MMP1升高可能代表另一类系统性生物学状态。更重要的是，空间分析并未显示两组在整体免疫细胞浸润上有显著差异，却揭示出上皮区室内纤连蛋白与α-SMA富集这一更具区室特异性的耐药特征。作者认为，这种现象可能与CAFs浸润、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关表型，或空间分割中的紧密邻近信号有关，但文中并未作确定性归因，因此总体表述保持审慎。文章同时指出，纤维化和免疫抑制性肝转移微环境中的成纤维细胞相关通路，可能成为LRT联合治疗的新方向，而MMP1也可能成为值得进一步验证的潜在干预靶点。

研究结论部分可译为：
整合血浆蛋白质组学与空间分辨肿瘤分析，为探索转移性乳腺癌中的肿瘤—宿主相互作用提供了一种有前景的综合框架。在这项探索性研究中，系统性与空间蛋白质组信号的联合分析揭示了与治疗结局相关的潜在生物标志物及微环境特征。然而，鉴于队列规模有限，这些发现应谨慎解读，并视为假设生成性结果。未来仍需在更大规模、独立队列及前瞻性临床研究中进一步验证这些观察结果，并确定其潜在临床意义。