不同Wx基因型水稻淀粉分支酶（Starch Branching Enzyme, SBE）与可溶性淀粉合酶（Soluble Starch Synthase, SSS）基因编辑的多面效应

《Rice》：Multifaceted Effects of Starch Branching Enzyme and Soluble Starch Synthase Gene Editing in Rice with Different Wx Genotypes

　　

水稻胚乳作为谷物的主要食用部分，通过提高其抗性淀粉（Resistant Starch, RS）含量，在调节血糖和预防肠道疾病方面发挥重要作用。既往研究表明，通过基因组编辑抑制支链淀粉生物合成可增加RS含量。然而，不同Waxy（Wx）等位背景对编辑株系中RS积累的影响尚未得到系统评估。在本研究中，研究人员以携带非功能性wx等位基因的糯稻云南黑香糯（Yunan Heixiangnuo, HXN）和携带弱Wxb等位基因的籼稻宜香1B（Yixiang 1B, YX1B）为背景，利用CRISPR/Cas9同时敲除SSSIIIa、SBEI、SBEIIa和SBEIIb，并系统分析了RS含量、稻米品质及产量性状的变化。结果表明，在HXN背景下，多基因敲除未显著改变直链淀粉或RS含量，但在很大程度上保持了良好的食味品质。相比之下，在YX1B背景下，四基因敲除株系的直链淀粉含量从17.7%增加至53.7%，RS含量增加至2.48%，较野生型增加了4.35倍，而胶稠度和结实率显著降低。扫描电子显微镜观察显示，多基因敲除显著重塑了淀粉颗粒结构，从致密的 polygonal 颗粒转变为松散堆积的球形颗粒，并导致粉质胚乳。综上所述，通过多基因编辑增强RS含量受Wx基因功能的影响。尽管wx等位基因未能增加RS含量，但它仍通过调节淀粉结构参与调控籽粒品质和产量性状。本研究在为平衡产量表现和食味品质培育高RS水稻品种方面提供了参考。

研究背景方面，水稻胚乳是谷物主要食用部分，约占种子干重80–90%，是人类主要能量来源，由直链淀粉和支链淀粉组成，其中直链淀粉含量强烈影响质地与食味品质。从营养角度，淀粉可分为快速消化淀粉、慢速消化淀粉和抗性淀粉（Resistant Starch, RS），RS限制淀粉酶对淀粉分子的可及性而抵抗消化，类似膳食纤维作用于血糖调节、脂质代谢和肠道健康。常规稻米RS含量低，通常占熟米的3%以下，提高稻米RS含量被视为改善营养质量和支持饮食干预慢性疾病的策略。水稻淀粉生物合成依赖多种酶协同作用，其中淀粉分支酶（Starch Branching Enzyme, SBE）包括OsSBEI、OsSBEIIa和OsSBEIIb，在支链淀粉形成中起关键作用，OsSBEIIa与OsSBEIIb部分功能冗余，OsSBEIIb在胚乳特异性表达并决定支链淀粉结构；可溶性淀粉合酶IIIa（Soluble Starch Synthase IIIa, SSSIIIa）缺失在特定Wx背景下可增加RS含量并影响淀粉颗粒形态与理化性质。Waxy（Wx）基因编码颗粒结合型淀粉合酶I（Granule-Bound Starch Synthase I, GBSSI），是决定直链淀粉含量的主要遗传因子，其等位基因包括高表达的Wx^a（直链淀粉约20–30%）、低表达的Wx^b（约10–20%）和功能缺失的wx（<2%，典型糯稻）。既往提高RS的研究多聚焦Wx^a背景的多基因编辑，常伴随食味品质和产量大幅下降，且不同Wx等位背景对编辑株系RS积累的影响尚未系统评估，因此开展本研究以考察多基因编辑在不同Wx背景下对RS积累、品质及产量的影响，为平衡产量与食味的高RS育种提供参考，论文发表于《Rice》。

主要关键技术方法包括：以糯稻云南黑香糯（HXN，wx等位基因）和籼稻宜香1B（YX1B，Wx^b等位基因）为样本队列背景；采用基于CRISPR/Cas9的多重基因组编辑系统同时靶向OsSBEI、OsSBEIIa、OsSBEIIb和OsSSSIIIa四个淀粉生物合成相关基因；在两种背景下获得纯合突变体；系统分析突变体的淀粉组分（直链淀粉含量、RS含量、总淀粉含量）、籽粒外观（垩白度、粉质胚乳）、食味品质（胶稠度、总蛋白含量）、农艺性状（株高、穗长、每穗粒数、结实率、千粒重）；利用扫描电子显微镜观察淀粉颗粒形态与排列；进行基因相对表达量分析与酶活性测定。

研究结果部分保留小标题逻辑依次说明：首先为多基因编辑对淀粉组分的影响，在HXN背景下获得6个纯合突变系均携带SSSIIIa缺失，表观直链淀粉含量（Apparent Amylose Content, AAC）为2%–4%，与野生型无显著差异，RS含量也无显著变化，归因于非功能性wx等位基因；在YX1B背景下，AAC随突变基因累积而增加，SBEI/SBEIIa/SBEIIb/SSSIIIa-KO四敲除系AAC从17.7%增至53.7%，RS含量增至2.48%（较野生型增4.35倍），总淀粉含量降低，符合AAC与RS正相关报道；尽管Wx^b相对表达量在四敲除系中显著降低，直链淀粉仍高水平积累，表明直链淀粉积累不仅依赖Wx转录丰度比例增加，而是由淀粉生物合成网络中碳分配改变驱动，抑制SBE活性减少支链淀粉合成使更多ADP-葡萄糖供GBSSI促进直链淀粉合成，且SBE活性降低限制支链淀粉形成并促进线性葡聚糖链积累，OsSSSIIIa缺失的补偿调控也强化代谢调整。其次为籽粒外观与酶活性变化，YX1B背景多基因敲除导致明显粉质胚乳，SBEIIa/SBEIIb-KO和四敲除系垩白度较野生型增约5–6倍呈不透明粉质表型；四敲除系淀粉分支酶和淀粉合酶活性显著降低；HXN本身具粉质胚乳无法定量垩白。再次为淀粉颗粒形态观察，扫描电镜显示野生型HXN颗粒多为多边形、表面光滑致密堆积，随突变基因增加颗粒渐小、排列变松并最终成球形，SBEIIa/SBEIIb/SSSIIIa-KO系中小颗粒聚集成不规则多边形且疏松；野生型YX1B颗粒多边形、排列规则紧密，随编辑基因增加渐变为细小球形、堆积密度降低，表明多基因敲除重塑淀粉颗粒形态与堆积模式，为粉质胚乳和高垩白提供结构基础。接着为食味品质分析，HXN背景突变系胶稠度与野生型相当且均超80 mm，与直链淀粉含量不变一致，总蛋白含量随编辑基因增加而显著降低，表明HXN背景敲除系大体保持良好蒸煮食味品质；YX1B背景胶稠度随直链淀粉升高显著下降，SBEIIa/SBEIIb-KO和四敲除系分别降至约35 mm和47 mm，显著低于野生型，总蛋白含量显著升高，表明YX1B背景多基因敲除在提升RS同时伴随蒸煮食味品质下降。最后为农艺性状评估，HXN背景多数敲除系株高、穗长、每穗粒数与野生型无显著差异，但两个三敲除系结实率降低约四分之一，SBEI/SBEIIa/SSSIIIa-KO千粒重降10.9%，SBEIIa/SBEIIb/SSSIIIa-KO降19.14%；YX1B背景敲除突变体穗长与每穗粒数无显著变化，SBEIIa/SBEIIb-KO和四敲除系株高显著降低，四敲除系结实率较野生型降约四分之一，千粒重大幅降约40%；表明多基因敲除在两Wx背景下均与结实率和粒重降低相关，YX1B背景效应更显著，虽四敲除系单株估产大幅下降，但单株RS产量仍高于野生型YX1B，体现产量与RS积累的权衡。

讨论部分总结：糯稻粘性源于Wx基因天然突变致GBSSI活性和直链淀粉合成丧失，既往高RS研究多聚焦Wx^a栽培种；本研究发现非功能性wx等位基因的HXN中支链淀粉合成基因多基因编辑未能提高RS，表明直链淀粉合成对RS积累至关重要；弱Wx^b的YX1B中多基因敲除使直链淀粉增三倍余、RS增四倍余，证明Wx等位型起决定性作用；相较既往Wx^a背景四敲除，Wx^b背景RS积累显著更低，反映Wx等位基因功能分化及Wx^a更强GBSSI活性、更高直链淀粉与长链葡聚糖比例利于RS形成；仅改造支链淀粉结构在GBSSI活性受限时不足以实现高RS积累，直链淀粉合成能力与支链淀粉链长架构均为RS形成关键限制因素；Wx^b背景RS增幅有限源于直链淀粉合成不足与长链葡聚糖形成减少；多基因敲除均致产量下降但受影响性状因背景而异且与RS水平无严格相关；尽管四敲除系单株估产大降，单株RS产量仍高于野生型YX1B，存在产量与RS积累权衡；垩白在多基因敲除后普遍存在，与各背景淀粉颗粒结构改变和疏松堆积相关；综上，Wx等位基因在平衡RS含量、产量与籽粒品质中起关键作用，为高RS导向水稻育种提供指导。

研究结论部分翻译：糯稻的粘性源于Waxy（Wx）基因的天然突变，该突变消除了颗粒结合型淀粉合酶（Granule-Bound Starch Synthase I, GBSSI）活性和直链淀粉合成。因此，大多数提高抗性淀粉（Resistant Starch, RS）含量的努力都集中在携带强Wx^a等位基因的栽培品种上。在本研究中，研究人员比较了不同Wx等位背景下的RS形成。在携带非功能性wx等位基因的黑香糯（Heixiangnuo, HXN）中，支链淀粉生物合成基因的多基因编辑未能增加RS含量，表明直链淀粉合成对RS积累至关重要。相比之下，在携带弱Wx^b等位基因的宜香1B（Yixiang 1B, YX1B）中，多基因敲除使直链淀粉含量增加了三倍以上，RS含量增加了四倍以上，证明了Wx等位类型的决定性作用。与先前报道的Wx^a背景下的四基因敲除相比，Wx^b背景下的RS积累显著降低，反映了Wx等位基因在淀粉生物合成中的功能分化，以及Wx^a支持RS形成的更强能力。既往研究表明，Wx^a编码的GBSSI酶比Wx^b更具活性，导致更高的直链淀粉合成和更大比例的长链葡聚糖，这两者均与RS形成呈正相关。尽管两项研究都涉及支链淀粉生物合成途径的破坏，但靶向基因不同。在本研究中，SSSIIIb的破坏可能比Wx^a背景中报道的SBEIIa破坏对长链支链淀粉分布产生更强影响。然而，尽管这些对链长分布的潜在更强影响，Wx^b背景下的RS积累仍然明显较低。这些结果表明，当GBSSI活性受限时，仅修饰支链淀粉结构不足以实现高RS积累。相反，直链淀粉生物合成能力和支链淀粉链长结构都是RS形成的关键限制因素。因此，Wx^b背景下观察到的适度RS增加可能是由于直链淀粉合成不足和长链葡聚糖形成减少共同限制了RS积累。尽管多基因敲除一致导致产量降低，但受影响的性状因背景而异，且与RS水平无严格相关性。值得注意的是，尽管SBEI/SBEIIa/SBEIIb/SSSIIIa-KO系的单株估计谷粒产量大幅降低，但其单株RS产量仍高于野生型YX1B，表明谷粒产量与RS积累之间存在权衡。垩白在多基因敲除后常见，并与所有背景下淀粉颗粒结构改变和疏松堆积相关。总体而言，这些结果突出了Wx等位基因在平衡RS含量、产量和籽粒品质方面的关键作用，并为面向RS的水稻育种提供了有用指导。

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