《Conservation Genetics》：Developing a GTseq panel for individual identification and evaluating application for native and transplanted Sitka black-tailed deer populations
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种群大小估计对于确定受猎物种的可持续捕捞水平至关重要。通过非侵入性遗传采样的空间捕获-再捕获是估计种群大小的一种方法，尤其适用于无法进行航空调查的栖息地。DNA测序技术的发展导致了基于扩增子的千级基因分型测序（GTseq）在组织和非侵入性遗传样本基因分型中的应
种群大小估计对于确定受猎物种的可持续捕捞水平至关重要。通过非侵入性遗传采样的空间捕获-再捕获是估计种群大小的一种方法，尤其适用于无法进行航空调查的栖息地。DNA测序技术的发展导致了基于扩增子的千级基因分型测序（GTseq）在组织和非侵入性遗传样本基因分型中的应用。在此，研究人员开发并评估了一个用于个体识别的GTseq单核苷酸多态性（SNP）panel的效能。研究人员对来自阿拉斯加和不列颠哥伦比亚省本地和移植种群的Sitka黑尾鹿（Odocoileus hemionus sitkensis）组织样本进行了种群结构和多样性分析。随后，研究人员证明可以在阿拉斯加东南部中部（CSEAK）的粪便颗粒样本上进行个体匹配。该panel包含248个SNP，在所有采样种群中只需30个位点就具有足够的个体识别能力。研究人员识别出的种群结构与岛屿地理和移植历史相符。为了选择panel中的SNP，研究人员从CSEAK的一个岛屿采样了初始基因组数据，导致在CSEAK以外应用该panel时存在确认偏倚。研究人员强调，这种确认偏倚导致CSEAK以外种群的位点变异性降低。对于CSEAK以外的个体识别，研究人员建议子集化面板，仅使用对所研究种群可变的位点。如果打算估计CSEAK以外种群的多样性和分化模式，研究人员建议使用额外的全分布范围基因组数据重新设计panel。
**论文解读：开发用于Sitka黑尾鹿个体识别的GTseq SNP panel及其在本地与移植种群中的适用性评估**
**研究背景与问题**
种群大小估计是确定受猎物种可持续捕捞水平的关键依据。空间捕获-再捕获方法结合非侵入性遗传采样（如粪便DNA）可有效估计种群大小，尤其适用于无法进行航空调查的复杂栖息地。单核苷酸多态性（SNP）panel因其成本效益高、适合低质量DNA样本而逐渐被应用于野生动物监测。其中，基于扩增子的千级基因分型测序（GTseq）技术能够同时靶向数百个SNP，且制备和测序成本较低，已在鱼类、野生哺乳动物等物种的保护与管理中得到应用。Sitka黑尾鹿（Odocoileus hemionus sitkensis，简称SBTD）是阿拉斯加和不列颠哥伦比亚省的重要管理物种，既是区域食物资源，也是黑熊和狼的常见猎物。SBTD原生分布于阿拉斯加东南部和不列颠哥伦比亚省西北部，20世纪初被移植到阿拉斯加中南部、科迪亚克群岛和夏洛特皇后群岛。该物种面临历史及持续的木材采伐导致的栖息地改变，以及深雪冬季带来的种群数量下降。由于它们栖息于茂密、崎岖的沿海温带雨林，航空调查难以实施，因此非侵入性遗传捕获-再捕获成为有利方法。此前已有研究利用微卫星和线粒体单倍型分析SBTD的种群遗传学和丰度，但存在位点变异不足、个体识别能力低等问题。随着基因组方法的发展，研究人员设计了一个用于阿拉斯加SBTD个体识别的GTseq SNP panel，并评估其在不同种群中的适用性。
**主要技术方法**
研究人员采用限制性位点相关DNA测序（RADseq）从阿拉斯加东南部中部（CSEAK）米特科夫岛采集的15份耳组织样本中生成全基因组SNP集。通过Stacks软件进行SNP鉴定与筛选，选择次要等位基因频率（MAF）介于0.3–0.5的507个高变异SNP用于引物设计。与GTSeek公司合作设计引物，经多重PCR优化后保留248个位点。对来自阿拉斯加和不列颠哥伦比亚省七个区域（CSEAK、SSEAK、NSEAK、P. of Wales岛、SCAK、科迪亚克群岛、夏洛特皇后群岛）的237份组织样本和47份粪便样本进行GTseq基因分型。通过PCA和Admixture进行种群结构分析，计算不同区域的位点变异性（MAF和观测杂合度HO），并进行概率身份分析（PID）确定个体识别所需最少位点数。采用容错式似然匹配框架对粪便样本进行个体匹配。
**研究结果**
**1. 种群结构**
PCA分析揭示三个主要遗传簇：夏洛特皇后群岛、CSEAK/SSEAK/科迪亚克、NSEAK/SCAK。Admixture分析支持K=6，进一步将SSEAK中的P. of Wales岛分离出来。种群结构与岛屿地理和移植历史相符：SCAK种群源自NSEAK的移植，科迪亚克种群主要源自CSEAK的补充移植，夏洛特皇后群岛源自不列颠哥伦比亚省沿海大陆。
**2. Panel变异与确认偏倚**
由于Panel设计基于CSEAK单个岛屿的10个RADseq样本，存在确认偏倚：CSEAK的位点变异最高（无不变异位点），而SCAK变异最低（156个可变位点，156个不变异位点）。通过概率身份分析，即使在变异最低的SCAK区域，仅需30个相同位点即可实现高置信度个体识别（PIDSIBS<0.001），远低于248个总位点。
**3. 粪便样本匹配**
对米特科夫岛采集的45份粪便样本（浓度0.17–2.7 ng/μl）进行基因分型，经共识基因型构建和似然匹配后，匹配到35个独特个体，其中4个个体出现两次，3个个体出现三次，未发现跨网格匹配。基因分型错误率低（组织0.4%，粪便0.3%）。
**讨论与结论**
本研究开发的GTseq SNP panel在SBTD个体识别中表现良好，即使存在确认偏倚，仅需30个位点即可在阿拉斯加本地和移植种群中实现高置信度个体识别。然而，由于Panel设计基于单一种群，用于估计种群分化、多样性、亲缘关系等目标时需谨慎，因为CSEAK的位点变异被高估。建议未来在Panel设计时从整个应用范围内生成初始基因组数据，并增加样本量以提高位点选择准确性。对于CSEAK以外的个体识别研究，建议仅使用对目标种群变异较高的位点子集，以节约测序资源。该Panel为SBTD管理提供了重要工具，尤其适用于无法进行航空调查的区域，通过遗传空间捕获-再捕获估计种群大小，以监测自然和人为景观变化的影响，并指导可持续捕捞水平的确定。
