《Plant Biotechnology Journal》：Design and Immunogenicity of a Nanoparticle Combination Vaccine for Salmonella in Poultry
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肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)血清型（沙门氏菌）是细菌性胃肠炎（沙门氏菌病）的常见病因，通常与食用禽肉产品有关。肉鸡中沙门氏菌的控制较为困难，因为定植的禽鸟可能携带该病原体未被检出进入屠宰场并导致肉类污染。禽用疫苗可减轻定植，其中一种有
肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica)血清型（沙门氏菌）是细菌性胃肠炎（沙门氏菌病）的常见病因，通常与食用禽肉产品有关。肉鸡中沙门氏菌的控制较为困难，因为定植的禽鸟可能携带该病原体未被检出进入屠宰场并导致肉类污染。禽用疫苗可减轻定植，其中一种有前景的生产方法是通过植物。铁是沙门氏菌的必需营养素；因此，研究人员旨在利用铁摄取系统作为疫苗靶点，通过剥夺沙门氏菌的铁来防止其定植鸡只。该方法的一个挑战在于沙门氏菌拥有多种功能冗余的铁获取蛋白。因此，研究人员针对四种不同的沙门氏菌铁获取蛋白创建了基于纳米颗粒的植物生产疫苗候选物，以构建比单一蛋白靶向更有效的多价疫苗。每种蛋白的细胞外抗原肽被串联融合至自组装布鲁氏菌属(Brucella spp.) lumazine synthase的N端。这些融合构建体随后在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中表达。所得的重组蛋白被提取、纯化并表征。单独或联合给药的疫苗候选物在小鼠中引发了特异性抗体，并与沙门氏菌表面结合，表明其在预防家禽沙门氏菌定植方面的潜力。
该研究发表于《Plant Biotechnology Journal》。研究背景方面，禽肉产品受沙门氏菌(Salmonella)污染构成重大的食品安全与公共卫生威胁，也是家禽业经济损失的重要原因。肉鸡宰前有效控制沙门氏菌对降低影响至关重要。禽用沙门氏菌疫苗因成本较低且监管复杂程度低于人用疫苗，是一种经济高效的策略。亚单位沙门氏菌疫苗由对细菌存活至关重要的表面暴露蛋白作为抗原组成，在免疫识别上相比内部抗原有潜在优势，但利用毒力相关表面关联蛋白肽的研究疗效有限，仍需更有效的肉鸡沙门氏菌疫苗。沙门氏菌显示与铁获取相关的TonB依赖性外膜转运蛋白(TBDTs)，这些蛋白对铁摄取至关重要，是潜在的疫苗抗原靶点。鉴于TBDTs的功能冗余及其在铁摄取中的多样作用，选择性阻断单个TBDT可能不足以阻碍沙门氏菌生长存活所需的总体铁获取，因此研究人员战略性靶向四种TBDTs即CirA、FepA、FhuA和IroN作为抗原开发疫苗，旨在通过阻碍总体铁获取来限制沙门氏菌生长存活及定植家禽胃肠道(GI tract)的能力。
研究人员开展了基于纳米颗粒的植物生产多价疫苗设计、表达、纯化及免疫原性评估研究，得出植物生产的融合蛋白能引发特异性抗体并结合沙门氏菌表面的结论，具有重要意义，为对抗感染性疾病提供了创新解决方案并强调了疫苗技术领域持续探索的重要性。
作者为开展研究用到的主要关键技术方法包括：利用Phyre2服务器生成同源模型及DNAStar软件Protean 3D包预测抗原肽的疫苗构建体设计；将优化序列克隆至植物表达载体并通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导渗透法在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)中进行瞬时表达；利用固定化金属离子亲和色谱(IMAC)纯化重组蛋白；使用BALB/c小鼠（36只雌性，6至8周龄，分6组）进行动物免疫试验评估免疫原性；通过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)定量检测血清IgG抗体；进行沙门氏菌结合试验验证抗体与野生型TBDTs的结合能力。
研究结果部分保留小标题如下：
2 Results即结果部分。2.1 The Design, Expression and Purification of Vaccine Candidates即疫苗候选物的设计、表达与纯化。研究人员通过Phyre2预测CirA、FhuA和IroN的3D结构，利用DNAStar软件识别细胞外环上的抗原肽，并将这些肽串联融合至Brucella sp. lumazine synthase(BLS)的N端构建CLB、FLB和ILB疫苗候选物。构建体优化后在本氏烟草中瞬时表达，FLB在细胞质积累最高达0.81 mg/g鲜重(FW)，CLB在叶绿体达0.52 mg/g FW，ILB在内质网(ER)达0.99 mg/g FW，均超过经济可行积累水平0.1 mg/g FW，随后通过IMAC纯化获得重组蛋白。
2.2 Evaluating the Immunogenicity of IMAC-Purified Plant-Produced Vaccine Candidates即IMAC纯化的植物生产疫苗候选物的免疫原性评估。研究人员用纯化的CLB、FLB、ILB及此前生产的FR-BLS单独或混合免疫小鼠，在35天测试出血和49天最终出血检测血清IgG。结果显示免疫组均诱导了针对抗原肽的IgG抗体，测试出血混合组对各蛋白反应较弱，但最终出血混合组与单独免疫最终出血无显著差异（除FR-BLS外）。沙门氏菌结合试验显示免疫小鼠血清抗体与肠炎沙门氏菌(S. enteritidis)细胞共定位，阴性对照PBS组无信号，验证了疫苗候选物产生靶向免疫反应的能力。
讨论部分总结：研究人员讨论了利用抗原展示技术生产颗粒抗原作为疫苗候选物的趋势，自组装纳米颗粒作为平台的优势在于尺寸20至200 nm利于抗原呈递细胞摄取及密集重复表面结构增强免疫激活。研究所有疫苗候选物在本氏烟草中积累均超0.1 mg/g，BLS展示抗原肽并自组装成十聚体纳米颗粒诱导强免疫反应，且BLS具佐剂功能。针对TBDTs冗余性，评估了靶向四种TBDTs的联合疫苗，初次反应较低但二次加强后最终出血免疫反应显著恢复，表明联合疫苗在对抗沙门氏菌感染上潜在优于单独疫苗。植物生产纳米颗粒疫苗兼具可扩展性、成本效益与安全性，且植物本身可作为动物饮食部分实现口服治疗产品与疫苗生产无需昂贵纯化，成功开发针对沙门氏菌感染的植物生产疫苗候选物不仅解决全球食品安全问题，也为疫苗设计生产树立先例。
研究结论部分翻译：在这项研究中，研究人员使用BLS展示肠炎沙门氏菌的胞外抗原肽。已证明BLS组装成十聚体纳米颗粒，在其表面展示抗原，并诱导针对靶病原体的强保护性免疫反应。此外，已显示BLS在经口给药时无论是与抗原肽组合还是融合均发挥佐剂作用。此处研究人员显示植物生产的CLB、FR-BLS、FLB和ILB疫苗候选物在BALB/c小鼠中引发针对靶沙门氏菌TBDTs的强免疫反应。这种强免疫反应可能是由于抗原以多价形式呈递给免疫系统。TBDTs表现出冗余性并在铁摄取中发挥多种功能。因此，阻断特定TBDTs可能不足以充分阻碍沙门氏菌的总体铁获取。为应对此挑战，评估了靶向四种TBDTs即CirA、FepA、FhuA和IroN的联合疫苗。该方法背后的原理是阻碍总体铁获取，从而限制沙门氏菌的生长存活及其定植家禽GI tract的能力。初步结果显示联合疫苗中每种抗原的免疫反应低于单独制剂，然而第二次加强后，最终出血样本的免疫反应显著恢复。这些发现强调了联合疫苗方法的有效性，表明其在对抗沙门氏菌感染方面潜在优于单独疫苗。研究人员在植物中生产纳米颗粒疫苗的方法利用了植物蛋白生产的可扩展性、成本效益和安全性优势，增加了动物疫苗生产的工具箱。此外，由于植物是动物饮食的一部分，它们提供了生产动物口服治疗产品和疫苗的前景，无需昂贵的纯化过程。针对沙门氏菌感染的这些植物生产疫苗候选物的成功开发不仅解决了全球食品安全问题，也为未来疫苗设计和生产树立了先例。研究人员的研究指向对抗传染性疾病的创新解决方案，强调了在疫苗技术领域持续探索和发展的重要性。
