《Journal of Hazardous Materials》：Removal of aniline by biochar-immobilized fungal pellets is size-dependent: A spatial-temporal analysis at the microscale
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陆秋杰|向春雨|吴浩阳|刘世斌|刘刚|孙晓飞|罗正宇|李博文|邵怀勇中国四川省成都市610059，成都理工大学地质灾害防治与地质环境保护国家重点实验室，东三路1号二仙桥摘要基于生物炭的真菌固定化技术被广泛用于降解有机污染物，但影响丝状真菌颗粒性能的微观生化动态机制仍不明确。本研究
陆秋杰|向春雨|吴浩阳|刘世斌|刘刚|孙晓飞|罗正宇|李博文|邵怀勇
中国四川省成都市610059，成都理工大学地质灾害防治与地质环境保护国家重点实验室，东三路1号二仙桥
摘要
基于生物炭的真菌固定化技术被广泛用于降解有机污染物，但影响丝状真菌颗粒性能的微观生化动态机制仍不明确。本研究通过原位酶谱分析和平面光电检测技术，量化了金黄曲霉固定化颗粒在去除苯胺过程中的酶活性和pH值的微观分布情况。经过适应期后，采用响应面法优化了固定化真菌颗粒去除苯胺的条件。在12种生物炭中，700°C下热解的秸秆衍生磁性生物炭具有最高的苯胺吸附量（qe=16.36毫克/克），因此被选为载体。在优化条件下（接种量24毫升，生物炭用量1.2克，预吸附时间10小时，温度30摄氏度，pH值6.0），磁性生物炭固定化真菌颗粒在8天内可去除98.99%的苯胺，经过五次循环后仍保持74.10%的去除效率。对比三种不同尺寸的颗粒（1–2毫米、3–4毫米和5–6毫米）发现，其微观环境存在尺寸依赖性差异：与自由状态下的真菌相比，经过48小时培养后，最大β-葡萄糖苷酶活性影响半径可达26–34毫米，而自由状态下约为5毫米。酶活性和pH值梯度在颗粒核心附近最强，向外围逐渐减弱，且固定化真菌颗粒导致的核心酸化程度比自由状态下的真菌更严重。中等尺寸的颗粒（3–4毫米）在初期表现出最佳的微观性能，β-葡萄糖苷酶活性峰值可达2.27微摩尔/平方厘米·小时，比自由状态下的真菌高61%。这些研究结果揭示了固定化真菌颗粒中生化活性的由内而外的衰减规律，并表明颗粒尺寸是优化真菌修复系统的重要设计参数。
引言
由于具有耐受恶劣环境及拥有多种氧化酶等独特的生理生态优势，真菌生物修复有机污染物的方法越来越受到关注[1]、[2]。在有效作用范围内，丝状真菌可通过菌丝网络以及相关的营养输送过程，促进疏水性污染物的迁移与转移[3]、[4]。然而，在自然环境中，自由状态的真菌往往具有有限的修复效率，因为高浓度的污染物以及不利的环境因素（如不适宜的pH值或温度、抑制性共污染物）会限制其代谢活动和酶的表达[5]、[6]、[7]、[8]。
将真菌固定在稳定载体上可以缓解这些限制，提高其抗逆性并提升整体修复效果[9]、[10]。在各种载体（合成聚合物、无机材料以及生物炭）中，生物炭因其良好的微生物相容性以及吸附-生物修复协同作用潜力而备受青睐[11]、[12]。例如，将改性生物炭与外源真菌Scedosporium sp. ZYY结合使用，可有效提升对受石油污染的潮间带泥滩沉积物的修复效果，进一步证明了生物炭-真菌体系在不同污染介质中的应用价值[13]。重要的是，基于生物炭的固定化修复效果很大程度上取决于原料类型和热解温度，因为这些因素会影响生物炭的孔结构、表面化学性质以及吸附能力[14]、[15]、[16]、[17]、[18]。此外，通过磁性修饰（如引入Fe3O4）不仅可以方便地分离固定化后的真菌颗粒，还可能形成导电路径，从而促进界面处的电子传递，有研究表明这有助于提升某些修复系统的效率[19]、[20]。但对于那些依赖菌丝延伸来降解污染物的真菌而言，生物炭的孔结构及表面化学性质究竟如何影响固定化真菌颗粒的微观环境，进而影响污染物去除效率，目前仍不清楚。尤其是它们对菌丝穿透、营养物质扩散以及菌丝与生物炭界面处胞外酶空间分布的影响，目前了解甚少。
生物炭固定化真菌颗粒的独特结构会导致污染物去除效果及微观环境条件出现径向梯度[21]、[22]。在生物界面层面，真菌与载体之间的相互作用发生在微米级别（5–50微米），这一尺度与菌丝直径（2–10微米）以及生物炭的微孔结构相匹配。这些局部相互作用会在颗粒周围进一步形成更广泛的酶活性和pH值径向梯度[23]、[24]。这些微观过程往往伴随着局部pH值下降以及酶活性上升的现象[25]、[26]。然而，传统的基于破坏性采样的批量检测方法虽然能够了解整体的污染物去除情况，却无法识别出酶活性的“热点区域”，也无法将去除效果与局部微观条件联系起来[27]、[28]、[29]。这一局限性阻碍了人们对真菌-生物炭复合系统中协同修复机制的理解。
近年来，原位技术如平面光电检测技术（可用于二维化学特性监测，如pH值）和酶谱分析技术（可通过荧光底物水解反应来检测酶活性）的出现，使得人们能够观测到这些微观动态过程及其相关的生物地球化学效应[30]、[31]、[32]、[33]、[34]。例如，平面光电检测技术能够在保持样品结构完整的前提下，实时实现对关键化学特性（如pH值）的二维映射[30]。而原位酶谱分析则可以通过荧光底物水解反应来识别酶活性热点，从而揭示重要的生物地球化学过程[32]。这些技术有望帮助人们了解真菌-生物炭界面处的微米级氧化还原梯度，以及酶促修复途径与非生物修复途径之间的空间关联。
苯胺是一种常见的有毒芳香族胺类物质，广泛存在于工业废水当中。本研究以在300、500和700摄氏度下热解的咖啡渣生物炭和秸秆生物炭上固定的、经过适应处理的金黄曲霉为研究对象，部分样品还进行了Fe3O4修饰处理[35]。研究人员制备了三种不同尺寸的颗粒（1–2毫米、3–4毫米和5–6毫米），并利用原位酶谱分析和平面光电检测技术，在50–400微米的成像尺度上分析了苯胺去除过程中酶活性和pH值的径向梯度变化。本研究的目标是：（1）筛选出最适的生物炭材料，以提高固定化真菌颗粒的苯胺去除效率；（2）阐明生物炭固定化真菌颗粒是如何调控其微观环境的pH值和酶活性，从而实现苯胺去除的。基于传输-代谢耦合理论，我们推测酶活性和去除效率从颗粒核心向外围逐渐降低，而pH值则逐渐上升至背景值，这两者共同构成了生物修复过程中的有效多组分作用半径概念（见图1）。这一框架为优化颗粒尺寸以及内部微观环境结构提供了理论依据，对于设计和改进用于废水处理的固定化真菌系统具有重要的意义。
章节节选
材料
金黄曲霉NDM3-2是从北京生物银行生物技术有限公司购买的（中国北京；原始菌株编号NDM3-2；起源国：美国）。咖啡渣和秸秆被选作生物质原料，因为它们是大量存在、成本低廉且可再生的有机废弃物，非常适合用于生产生物炭以及后续的真菌固定化处理[36]、[37]。磁性基质的前体物质为分析级NaOH、FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O。钠元素
真菌的适应处理及苯胺去除条件的优化
将金黄曲霉接入液体营养培养基后，会经历一个很短的滞育期（0–2天），随后进入指数生长阶段（3–6天），接着是稳定期（7天），最后是晚期稳定期（第9天左右）（见图S4）。因此，后续的去除效果研究选择了8天的实验周期。
该真菌在逐渐升高的苯胺浓度下展现出出色的去除潜力（见图2）。随着苯胺浓度从20毫克/升升高到100毫克/升，其去除效率
结论
本研究开发了一种基于成像技术的分析框架，通过原位酶谱分析和平面光电检测技术，将宏观层面的苯胺去除效果与微观层面的酶活性及pH值变化联系起来。首先让金黄曲霉适应苯胺环境，然后系统地筛选出最佳培养条件。研究人员准备了12种不同的生物炭，并测试了它们的苯胺吸附性能，其中秸秆衍生的生物炭表现出最佳的吸附效果，因此被选为后续研究的载体
CRediT作者贡献说明
孙晓飞：写作——审阅与编辑。刘刚：写作——审阅与编辑。刘世斌：写作——审阅与编辑，指导，方法设计，概念构建。吴浩阳：实验研究。向春雨：写作——审阅与编辑，初稿撰写，定量分析。陆秋杰：初稿撰写，软件应用，方法设计，定量分析，数据整理。邵怀勇：写作——审阅与编辑。李博文：写作——审阅与编辑。罗正宇：方法设计。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本研究得到了成都理工大学珠峰科学研究计划（2024ZF11422）以及四川省自然科学基金（2024NSFSC0851）的支持。
研究意义说明
尽管固定化真菌颗粒在高效去除污染物方面具有巨大潜力，但决定其去除性能的微观机制目前仍不十分清楚。本研究通过原位酶谱分析和平面光电检测技术，证明了颗粒尺寸会通过影响
