综述：用于基因组编辑和分子诊断的增强型CRISPR-Cas系统

《Interdisciplinary Medicine》：Enhanced CRISPR-cas systems for genome editing and molecular diagnostics

　　

CRISPR-Cas系统对基因组编辑和分子诊断具有深远影响，并正成为生物医学研究和临床实践中的重要工具。这些系统能够实现精确的遗传操作和高灵敏度的核酸检测，这些能力对于治疗开发和病原体监测具有不可估量的价值。然而，天然CRISPR-Cas系统存在固有的局限性，限制了其更广泛的应用。在基因组编辑中，这些局限性包括编辑效率不足、因原型间隔区相邻基序（PAM）限制导致的靶点范围受限以及不可忽视的脱靶效应。在分子诊断中，剩余的问题包括检测低丰度靶标、实现高特异性以及确保与等温扩增的有效兼容性。为了解决这些局限性，研究人员提出了许多增强策略，主要围绕四个方面：Cas效应蛋白工程、优化引导RNA（gRNA）设计、开发先进的报告探针以及利用化学添加剂。本综述总结了这些领域的最新进展，并强调了它们对提高编辑保真度和诊断灵敏度的重大贡献。此外，研究人员讨论了增强型CRISPR-Cas系统的未来前景，重点关注其加速临床转化和扩展生物医学应用。

1 引言

基因组编辑和分子诊断构成精准医学的核心组成部分，其发展高度依赖于稳健、高特异性和高效的分子工具。CRISPR-Cas系统源自原核生物适应性免疫防御，经工程化改造后被广泛应用于基因组编辑和分子诊断。某些Cas蛋白（如Cas9、Cas12、Cas13）在识别靶标后表现出附带切割（反式切割）活性，可降解附近单链DNA或RNA，用于诊断中的信号放大，例如荧光团-淬灭剂（FQ）报告探针的切割。然而，天然CRISPR-Cas系统在基因组编辑中存在编辑效率低、脱靶效应显著以及PAM限制；在分子诊断中则面临低丰度靶标灵敏度不足、特异性不够以及与等温扩增兼容性差等问题。研究人员发展了四种主要增强策略：Cas蛋白工程、gRNA优化、报告探针开发以及化学添加剂引入。本综述总结这些进展，并讨论未来方向。

2 用于基因组编辑和分子诊断的CRISPR-Cas系统

CRISPR-Cas系统分为两大类，Class 2系统（如Type II、V、VI）因结构简单且易于工程化而成为首选平台。Cas9（Type II）介导双链DNA（dsDNA）的序列特异性切割；Cas12（Type V）靶向dsDNA并具有反式单链DNA（ssDNA）核酸酶活性；Cas13（Type VI）靶向单链RNA（ssRNA）并显示反式RNA酶活性。在基因组编辑中，gRNA与Cas蛋白形成核糖核蛋白（RNP）复合物，通过碱基配对结合靶DNA，诱导双链断裂（DSB），随后通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）修复。在分子诊断中，基于Cas12和Cas13的反式切割活性，检测平台如DETECTR、SHERLOCK和HOLMES利用FQ报告探针产生荧光信号。Cas9在双RNA引导下也表现出反式切割活性，从而开发了DNA激活和RNA激活的Cas9检测平台。

3 用于基因组编辑的增强型CRISPR-Cas系统

3.1 Cas蛋白工程用于增强基因组编辑

3.1.1 减少脱靶效应

通过理性设计或定向进化产生高保真Cas9变体，如SpCas9-HF1、eSpCas9(1.1)，通过破坏非特异性DNA接触降低脱靶效应，同时保持≥70%的野生型活性。evoCas9经酵母定向进化，特异性比野生型SpCas9高79倍，且脱靶活性极低。Sniper-Cas9通过细菌筛选获得，几乎保持野生型效率且脱靶显著降低。HiFi-Cas9变体在人原代细胞中表现出高效基因组编辑，将脱靶效应降低多达20倍。蛋白质语言模型可预测并减轻脱靶效应，如Silverstein等利用大规模模型设计高保真变体。Feng等采用进化尺度语言模型识别出新型Cas12a亚型，具有固有切割偏好和低脱靶活性。二聚化依赖系统（如fCas9）通过融合FokI核酸酶域与失活Cas9（dCas9），需要两个gRNA结合事件触发DNA切割，特异性提高超过140倍。

3.1.2 扩展PAM识别范围

SpCas9识别NGG PAM，限制了靶向范围。理性设计的SpCas9-NG识别松弛的NG PAM，支持高效编辑。xCas9通过噬菌体辅助连续进化（PACE）技术产生，可识别多种PAM（NG、GAA、GAT），且DNA靶向特异性更高。经PACE进化产生的SpCas9-NRCH可识别更简并的PAM（NRCH）。其他Cas9直系同源物如Faecalibaculum rodentium Cas9靶向NNTA PAM；增强的Francisella novicida Cas9变体识别NRG/NGR PAM，靶向位点增加约3.5倍。Cas12家族中，工程化enAsCas12a接受更宽的PAM（TTTN、TTCN），靶向位点增加约7倍；高保真版本enAsCas12a-HF1保持编辑性能并减少脱靶位点约47%。Cas12iMax识别最小PAM（NTNN、NNTN），靶向超过70%人类基因组。优化Cas12f1直系同源物识别简化PAM，编辑效率显著提高。机器学习方法如Protein2PAM可准确预测PAM特异性，产生具有更宽PAM识别和更高切割速率的变体。高保真变体如SpCas9-HF1、evoCas9、enAsCas12a提供了通用工具包，AI辅助方法进一步促进理性设计。

3.2 gRNA工程用于增强基因组编辑效率

3.2.1 化学修饰的gRNA

化学修饰可增强gRNA的核酸酶抗性、稳定性并调节相互作用。硫代磷酸酯（PS）修饰在5′和3′端引入，保护gRNA免受外切酶降解，保持细胞内活性。2′-O-甲基（2′-O-Me）修饰增加结构完整性和核酸酶抗性，与PS结合形成2′-O-甲基-3′-硫代磷酸酯（MS）杂合修饰，进一步改善稳定性。2′-氟（2′-F）修饰稳定核糖环并增强碱基配对，提高编辑效率。位点特异性MS修饰（如位点5和11）可将脱靶率降低多达120倍。锁核酸（LNA）或桥接核酸（BNA）在gRNA中心区域（10-14位）增加靶向特异性。组合修饰策略（如3′端2′-F修饰和伪尿苷（ψ）修饰的Cpf1 mRNA）将编辑效率提高300%以上并减少脱靶切割。

3.2.2 gRNA中的DNA替代

部分用DNA替代RNA碱基可降低合成成本并调节热力学稳定性。混合DNA-RNA gRNA保留最少5个RNA残基即可维持Cas9活性，且脱靶效应降低。Kartje等发现仅6-8个RNA残基仍支持稳健切割。Yin等系统评估发现，将5′端10个核苷酸替换为DNA，可保持高编辑效率并将脱靶降至不可检测水平。结构引导设计使gRNA中DNA含量高达57%，仍能有效编辑。Ahn等报道19个DNA残基和单个特定RNA核苷酸的gRNA可支持与天然crRNA相当的活性，并提高特异性。

3.2.3 gRNA序列的理性设计

将间隔区长度从20 nt缩短至17-18 nt（tru-gRNA）可减少脱靶效应高达5000倍，同时保持靶向活性。缩短间隔区长度会降低gRNA-DNA双链结合能，提高错配敏感性。截短3′端crRNA增强Cpf1复合物区分单碱基错配的能力。支架区域工程需平衡长度和必需结构基序。5′端延长Cpf1 crRNA 4-25 nt可显著提高NHEJ和HDR效率。PAM邻近位点1-4的鸟嘌呤提高编辑效率，而嘧啶抑制活性。3′端突出U4AU4序列可增强indel活性。缩短间隔区与高保真Cas9变体协同提高特异性。机器学习如DeepCRISPR用于设计优化gRNA，细胞类型特异性转录组分析指导靶点选择，可调合成支架调节活性。

4 用于分子诊断的增强型CRISPR-Cas系统

4.1 Cas蛋白工程用于增强分子诊断

高保真Cas9变体用于超精确核酸区分。Acharya等工程化FnCas9变体（en1、en15、en31），保持单核苷酸特异性同时将PAM要求从NGG放松至NRG/NGR，使可检测致病性单核苷酸变异数量翻倍。侧流层析检测显示信号区分提高3.9倍。Yin等工程化AapCas12b G478A/K396A突变（2M），减弱PAM近端DNA结合，使扩增子积累增加10-10000倍，成功检测所有85份SARS-CoV-2阳性临床样本。Cas13a的β-发夹环工程增强RNA结合亲和力，约3-5倍。Yin的REVERSE平台通过重新定向引物产生与病毒基因组反义扩增子，保护免于Cas13a切割。Nguyen等将高活性LbCas12a变体（D156R）、7 nt DNA延伸嵌合crRNA和双模式荧光素-生物素报告系统整合到ENHANCEv2平台，将CRISPR反应时间缩短至3分钟，并在室温下稳定数周。AI辅助机器学习模型如mutaSCAN系统，30分钟内检测SARS-CoV-2，检测限低至250拷贝/mL，通量达96次/轮。

4.2 gRNA工程用于增强分子诊断

4.2.1 化学修饰的crRNA

光响应化学修饰用于时序控制。NPOM-caged胸苷嵌入crRNA间隔区，光照射后恢复90%活性，结合RPA实现光控一锅法检测，灵敏度提高50倍。通用酰化策略修饰2′-OH，序列无关，POIROT平台灵敏度提高两个数量级。RRS-4单碱基NPOM取代完全抑制Cas12a活性，光照射后恢复，提供通用时空控制方法。

4.2.2 分裂crRNA

将crRNA分裂为支架和间隔区片段，保留Cas12a切割活性。竞争性结合策略利用全长和分裂crRNA实现级联信号放大，无需预扩增即可直接定量血浆miR-19a。分裂Cas12a系统用于检测miRNA和长RNA，无需逆转录或扩增。SMART策略利用间隔区RNA本身作为靶标，实现无扩增RNA检测，优化后达到attomolar灵敏度。光激活分裂crRNA系统通过光可裂解连接子连接空间位阻效应子（SHE），光照射后恢复功能，背景信号降低6.1倍，实现attomolar水平RNA检测。

4.2.3 延伸和结构工程化crRNA

G-四链体（G4）结构通过光可裂解连接子连接至crRNA 3′端，作为位阻阻断剂，一锅法检测HPV-16。AZD++稳定G4结构，UV照射后恢复Cas12a活性，灵敏度提高100倍。3′端7-mer ssDNA延伸将反式切割活性增强3.5倍，与多种间隔区序列兼容。5′端ssDNA延伸至tracrRNA，保持特异性并整合DNAzyme或生物素结合域。发夹-间隔区crRNA增加吉布斯自由能差异，单核苷酸多态性区分能力提高3倍。共价闭环crRNA抑制Cas12a活性，配体响应核酸酶切割后恢复线形，实现非核酸分析物检测。

5 报告探针工程用于增强分子诊断

传统FQ报告探针灵敏度有限。DNA茎环（发夹）报告探针将Cas12a反式切割的米氏常数降低5倍，15分钟内产生200倍信号增强。ssDNA报告长度15 nt和NEBuffer 4将反式切割活性提高约50倍，检测限降低近三个数量级。胞嘧啶同聚物长度至8 nt可提高第一次切割速率。多模式通用报告序列添加胸腺嘧啶（TTATT）使灵敏度提高10倍，支持多种读出模式。纳米材料报告探针如CRISPR-AIE系统，聚集诱导发光（AIE）分子嵌入dsDNA支架，每次切割释放多个发射体，信号增益80倍，检测限5 fM。框架热点报告（FHR）利用四足DNA框架（TDF）加速Cas12a切割4倍，15分钟内检测100 fM多病原体。金纳米颗粒（AuNP）介导的金属增强荧光系统实现无扩增检测，检测限达fM水平。酶联报告系统如辣根过氧化物酶偶联ssDNA，切割后触发化学发光，信号增强75倍，检测10 fM SARS-CoV-2 RNA，并可扩展至非核酸靶标。

6 化学添加剂的引入

6.1 化学添加剂用于增强基因组编辑

金属离子Mg²⁺是几乎所有Cas核酸酶（Cas9、Cas12、Cas13）切割功能的关键辅因子，其浓度需优化以平衡效率与脱靶。Mn²⁺可增强Cas12a活性，通过诱导构象变化放松靶标识别严谨性，加速催化周转。小分子如L755507和Brefeldin A将HDR效率提高约3倍和2倍。AZT和TFT抑制HDR并促进NHEJ。RS1（RAD51激活剂）将HDR效率提高3-6倍。2iHDR策略结合AZD7648（DNA-PK抑制剂）和Polθ抑制剂（PolQi1/2），将HDR效率提高4.9-12.6倍，indel减少22.4倍。VE-822和AZD-7762增强Cas12a介导的敲入效率。

6.2 化学添加剂用于增强分子诊断

Mg²⁺对Cas12a和Cas13a反式切割至关重要。Mn²⁺显著增强Cas12a活性，可能降低反式切割活化能，使SARS-CoV-2 RNA检测限低至5拷贝。表面活性剂如阴离子和非离子型增强LbCas12a活性，阳离子型抑制。优化缓冲液Buffer Pro含聚乙烯吡咯烷酮（PVP），增强多种Cas效应子活性，临床样本检测灵敏。二硫苏糖醇和聚乙烯醇通过诱导构象变化暴露活性位点，将反应时间缩短75-83%。甘油诱导RPA与Cas12a相分离，防止提前切割，灵敏度提高100倍。L-脯氨酸和牛血清白蛋白稳定Cas酶，改善扩增特异性。

7 结论与未来展望

CRISPR-Cas系统通过Cas蛋白工程、gRNA优化、报告探针设计和化学添加剂等策略，在效率和特异性方面取得显著提升。然而，高保真变体可能以牺牲靶向效率为代价，化学修饰可能延长gRNA半衰期增加脱靶风险，先进报告探针合成复杂且成本高。未来方向包括：AI驱动的上下文感知工具设计，整合基因组、表观遗传和细胞类型转录组数据；细胞/组织特异性递送系统，如脂质纳米颗粒和病毒样颗粒；即时检测创新，如冻干一锅法、智能手机读出和微流控芯片。系统级整合多种技术将推动CRISPR系统在基因组编辑和分子诊断中的临床转化。