宿主内串联重复blaKPC-14介导高毒力ST11肺炎克雷伯菌对头孢他啶-阿维巴坦、头孢地尔及氨曲南-阿维巴坦交叉耐药的进化研究

《Journal of Infection》：Within-host evolution of tandemly duplicated blaKPC14 conferring cross-resistance to ceftazidime-avibactam, cefiderocol and aztreonam-avibactam in hypervirulent ST11 Klebsiella pneumoniae

　　

目的：高毒力碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(hv-CRKP)表现出对多种抗菌药物的交叉耐药，构成严峻的治疗挑战。因此，阐明驱动抗菌药物耐药的机制至关重要。方法：研究人员恢复了一株头孢他啶-阿维巴坦(CZA)耐药的肺炎克雷伯菌分离株，并进行了抗菌药物敏感性试验和全基因组测序。研究人员通过基因克隆和酶动力学测定研究耐药机制。研究人员查询公共NCBI数据库以确定多拷贝blaKPC基因的流行率。研究人员进行生长曲线和质粒稳定性测定以评估适应性代价。结果：研究人员在长期CZA治疗后鉴定出一株携带两个IS26介导的blaKPC-14拷贝的hv-CRKP分离株。该菌株对CZA、头孢地尔(FDC)和氨曲南-阿维巴坦(AZA)表现出高水平耐药，且无明显的适应性代价。在整个治疗过程中，危重患者的估算肾小球滤过率持续升高。比较质粒分析表明，IS26介导的串联重复在携带多拷贝blaKPC的质粒中广泛存在。结论：长期CZA治疗的选择压力，以及可能影响抗菌药物暴露的宿主相关因素的潜在贡献，可能促进blaKPC变异体的出现，从而导致交叉耐药。双拷贝blaKPC在不施加显著适应性负担的情况下大幅提高了耐药水平。这些发现强调了及时的基因组监测和抗菌药物敏感性试验对于优化抗菌治疗的价值。

本研究围绕高毒力碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(hv-CRKP)对头孢他啶-阿维巴坦(CZA)、头孢地尔(FDC)及氨曲南-阿维巴坦(AZA)交叉耐药的机制展开。当前，肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)已成为全球重大公共卫生威胁，尤其在中国等地，KPC产酶菌的流行使得CZA作为有效治疗药物面临日益增多的耐药挑战。耐药机制主要包括bla_KPC变异体获得、bla_KPC过表达及外膜蛋白丢失，而基因扩增事件在临床诊断中常被低估，但其可显著增强耐药表型。同时，高毒力与碳青霉烯耐药质粒的融合演化出hv-CRKP（尤其是ST11型），其在国内的广泛传播加剧了临床管理难度。单一分离株同时对CZA、FDC和AZA产生耐药的情况较为罕见，且双拷贝bla_KPC形成的分子机制尚不完全清楚。因此，研究人员旨在阐明体内双拷贝bla_KPC-14的形成机制及其对多重β-内酰胺类药物交叉耐药的贡献，为耐药监测和临床管理提供分子见解。该研究由Fuyao Hu、Yi Zhang、Mingju Hao、Wei Li完成，发表于《Journal of Infection》。

研究人员从2023年1月收治的一名63岁男性神经外科重症监护室(NICU)患者住院期间的合格痰标本中，相继分离得到两株碳青霉烯酶产肺炎克雷伯菌分离株QL697和QL698，以此作为研究样本来源。关键技术方法包括抗菌药物敏感性试验测定最低抑菌浓度(MIC)、全基因组测序(WGS)与混合组装及生物信息学注释分析、共轭实验验证质粒转移性、基于PCR验证基因拷贝数、定量实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析基因表达、CRISPR/Cas9介导的基因敲除与互补及单拷贝菌株构建、体外连续传代质粒稳定性评估、生长曲线测定适应性代价、酶动力学参数测定及分子对接分析。

结果部分如下。患者信息与分离株特征：初期分离株QL697携带bla_KPC-2，对CZA敏感，经标准剂量CZA治疗18天后分离到QL698。患者治疗期间血清肌酐偏低，估算肾小球滤过率(eGFR)持续偏高（166.84至189.38 mL/min）并伴有低白蛋白血症。QL698携带bla_KPC-14，对CZA（MIC >128 mg/L）、FDC（MIC = 16 mg/L）和AZA（MIC = 24 mg/L）呈高水平耐药，但对亚胺培南(IPM)和美罗培南(MEM)的MIC降低。肺炎克雷伯菌分离株的基因型特征：全基因组测序证实QL697与QL698均为ST11-KL64谱系，携带典型高毒力基因（iutA-iucABCD、iroN、rmpA、rmpA2、peg-344）及截短OmpK35和OmpK36GD变异体。两者仅存在3个单核苷酸多态性(SNP)，QL698由QL697演化而来，其bla_KPC-14为237-243环ΔG242-T243双缺失变异，且呈IS26介导的串联重复双拷贝结构（IS26-tnpR-ISKpn27-bla_KPC-14-ISKpn6-klcA-IS26重复两次）。该含双拷贝质粒缺乏IV型偶联蛋白及松弛酶，共轭实验未见转移。双拷贝bla_KPC-14对抗菌药物耐药的影响：转化实验显示bla_KPC-14本身即可引起CZA、FDC、AZA耐药及碳青霉烯类药物MIC回落；敲除后菌株恢复敏感，回补后耐药重现。单拷贝bla_KPC-14菌株（QL697-KPC14）CZA MIC为128 mg/L，而双拷贝QL698达1024 mg/L，FDC和AZA也相应增高，证实基因剂量效应显著提升耐药水平。多拷贝bla_KPC的分布与形成机制：检索NCBI RefSeq质粒数据库发现93个含多拷贝bla_KPC的质粒，其中31.18%为IS26-bla_KPC-IS26介导，29.03%为ISPsy42-bla_KPC-ISKpn6介导；多数来自肺炎克雷伯菌且含bla_KPC-2，IS26介导的顺式串联重复是主要机制，本研究的Tn6296 flanked by IS26结构在数据库中亦有类似记载。KPC-14酶的功能特征：酶动力学显示KPC-14对美罗培南(MEM)和亚胺培南(IPM)的Km升高、kcat/Km降低，水解活性减弱，与其碳青霉烯MIC降低相符；对头孢他啶(CAZ)的Km降低、催化效率提升约2倍；阿维巴坦(AVI)对KPC-14的Ki及IC50高于KPC-2，抑制效力下降；FDC对KPC-14的Ki及IC50约为KPC-2的十分之一，相互作用增强。结构建模显示ΔG242-T243缺失致237-243环内收，分子对接显示KPC-14与CAZ、AVI、FDC、ATM的结合能均低于KPC-2。携带双拷贝bla_KPC-14质粒的稳定性及相关适应性代价：体外无抗生素连续传代18天，双拷贝结构稳定未丢失；生长曲线显示QL698生长动力学良好，曲线下面积(AUC)大于对照株，双拷贝未造成明显生长缺陷或适应性代价。

讨论部分总结：研究人员在长期CZA治疗后鉴定出携带IS26介导串联双拷贝bla_KPC-14的高毒力ST11肺炎克雷伯菌，表型由CZA敏感演变为高水平耐药伴碳青霉烯MIC降低及FDC、AZA新发耐药，SNP证实为治疗期间体内演化。患者可能存在的增强肾清除率(ARC)致CZA暴露不足，构成选择窗口。KPC-14的ΔG242-T243缺失降低碳青霉烯水解效率但提升CAZ水解及AVI抵抗，结构改变亦影响FDC互动，同一结构改变导致CZA耐药及FDC、AZA交叉耐药。双拷贝bla_KPC-14通过基因剂量效应进一步提升耐药。IS26介导扩增是多拷贝bla_KPC常见机制，本研究拓展了IS26驱动扩增的KPC变异谱。双拷贝结构在无药压下稳定且无明显适应性代价，增强其临床存续传播风险。结论翻译：长期头孢他啶-阿维巴坦(CZA)治疗的选择压力，以及可能影响抗菌药物暴露的宿主相关因素的潜在贡献，可能促进bla_KPC变异体的出现，并因此促成交叉耐药。双拷贝bla_KPC在不施加显著适应性负担的情况下大幅提高了耐药水平。这些发现强调了及时的基因组监测和抗菌药物敏感性试验对于优化抗菌治疗的价值。

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