《British Journal of Haematology》：DHX15 affects AML1-ETO9a splicing together with HNRNPL, RBM33 in AML1-ETO-positive acute myeloid leukaemia
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由t(8;21)(q22;q22)产生的AML1-ETO (AE)融合基因代表了急性髓系白血病(AML)的一种常见亚型。在ETO（RUNX1伴侣转录共抑制因子1，也称为RUNX1T1）基因的第8和第9外显子之间保留第9a外显子生成了致癌性AML1-ETO9a
由t(8;21)(q22;q22)产生的AML1-ETO (AE)融合基因代表了急性髓系白血病(AML)的一种常见亚型。在ETO（RUNX1伴侣转录共抑制因子1，也称为RUNX1T1）基因的第8和第9外显子之间保留第9a外显子生成了致癌性AML1-ETO9a (AE9a)剪接变体。在此，研究人员揭示了RNA（核糖核酸）解旋酶DHX15（DEAH-box解旋酶15）在AE9a剪接和AML进展中的潜在参与。临床上，高表达的DHX15与AE阳性（AE+）AML患者中升高的AE9a/AE丰度和不良预后相关。DHX15敲低在体外损害细胞增殖，诱导S/G2细胞周期阻滞，并在体内延长携带AE+白血病的小鼠的总生存期。此外，DHX15敲低降低了AE和AE9a的表达，RNA免疫沉淀(RIP)显示DHX15与AE和AE9a转录本结合，RNA pull-down实验显示HNRNPL（异质性核糖核蛋白L）和RBM33（RNA结合基序蛋白33）与AE9a转录本的选择性相互作用。三维结构预测提示涉及DHX15、HNRNPL和RBM33的复杂调控复合物的形成。此外，在AE+ AML样本中，HNRNPL和RBM33基因表达与AE9a水平正相关。下调HNRNPL和RBM33降低了Kasumi-1细胞中AE9a的表达。总的来说，研究人员的发现支持了DHX15、HNRNPL、RBM33与AE9a剪接之间的关联，并提示它们在AE+ AML的白血病进展中的贡献。
**论文解读：DHX15与HNRNPL、RBM33共同调控AML1-ETO9a剪接促进急性髓系白血病进展**
**研究背景与问题**
急性髓系白血病(AML)是由白血病细胞遗传学异常或获得性体细胞突变驱动的造血恶性克隆增殖性疾病。染色体易位相关的原癌基因激活是最关键的遗传异常之一，为细胞提供增殖优势并导致分化/成熟障碍。t(8;21)(q22;q22)易位产生AML1-ETO (AE)融合基因，该融合基因保留AML1的Runt结构域和ETO的四个NHR（神经同源区域）结构域。由于缺失AML1的激活结构域，AE缺乏转录激活能力，根据美国国家综合癌症网络(NCCN)指南，AE阳性(AE+) AML通常与良好预后相关。然而，AE存在一种选择性剪接异构体——AML1-ETO9a (AE9a)，其来源于ETO基因第8和第9外显子之间额外第9a外显子（155 bp）的保留。第9a外显子提供一个终止密码子，产生羧基末端截短的AE9a蛋白，该蛋白缺失ETO蛋白的NHR3和NHR4结构域。与AE不同，AE9a单独在小鼠模型中即可介导白血病发生，并在AE+ AML患者中诱导不良预后。基因组分析发现AE病例中存在包括DEAD-box RNA解旋酶DHX15 p.R222G突变在内的复发性体细胞突变。该错义突变可能不影响DHX15的ATP酶或RNA结合能力，但模拟完全功能缺失的DHX15敲低导致剪接基因异常表达和选择性剪接事件增加，凸显了DHX15在AML中AE剪接的重要性。DHX15已知通过结合富含G-patch结构域的蛋白参与剪接体解聚，近期研究还显示DHX15监测早期剪接体组装并确保U2 snRNP（小核核糖核蛋白）与内含子结合的质量控制。这些背景促使研究人员探索DHX15与AE+ AML中AE选择性剪接之间的潜在关系。先前研究表明DHX15在AML中高表达且与较短总生存期(OS)和无复发生存期相关。本研究聚焦于DHX15在AE+ AML中的表达模式、功能作用及其与AE9a剪接的关联，旨在阐明其促进白血病进展的分子机制。该论文发表在《British Journal of Haematology》。
**主要技术方法**
研究使用了多来源样本队列：AE+ AML样本169例（福建协和医院85例，国内其他医院84例）和AE- AML样本114例（福建协和医院）。关键技术方法包括：实时定量PCR(RT-qPCR)检测基因表达；慢病毒介导的shRNA敲低(KD)和过表达(OE)进行功能扰动；流式细胞术分析细胞周期；CCK-8法评估细胞增殖；NCG小鼠皮下注射Luciferase标记的Kasumi-1细胞建立细胞系异种移植(CDX)模型，结合活体成像(IVIS)监测肿瘤生长和总生存期；RNA测序(RNA-seq)结合基因集富集分析(GSEA)鉴定信号通路变化；RNA免疫沉淀(RIP)检测蛋白-RNA结合；RNA pull-down结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定特异性RNA结合蛋白；ColabFold软件进行蛋白复合物三维结构预测。
**研究结果**
**1. DHX15与AE+ AML的不良进展相关**
通过分析169例AE+和114例AE- AML样本的DHX15表达，发现AE+ AML中DHX15表达显著低于AE- AML（p<0.001）。进一步根据中位DHX15表达将具有临床特征的28例AE+ AML患者分为高表达组和低表达组，Kaplan-Meier生存分析显示DHX15高表达与较短总生存期显著相关（高vs低组中位OS：10 vs 20个月，p=0.0275）。在Kasumi-1和SKNO-1细胞中，DHX15敲低抑制细胞增殖，且该效应可通过DHX15恢复实验逆转。在Kasumi-1 CDX小鼠模型中，DHX15敲低减轻了肿瘤生成和生长，并延长了总生存期（NC vs KD：26 vs 23天，p=0.003）。这些结果表明DHX15高表达促进AE+ AML的不良进展。
**2. DHX15敲低诱导AE+ AML细胞S/G2细胞周期阻滞**
对Kasumi-1和SKNO-1细胞进行RNA-seq和GSEA分析，发现DHX15敲低后细胞周期相关通路（如E2F靶点、G2M检查点）显著受抑制。流式细胞术验证显示DHX15敲低导致Kasumi-1和SKNO-1细胞S/G2期阻滞。Western blot分析表明DHX15敲低下调了细胞周期蛋白ATM、p-ATM、AKT、P53、MYC、cyclin A2和p-WEEL，上调了p-AKT、p-p53、p21和CDK2蛋白，且DHX15恢复实验逆转了这些变化。说明DHX15通过调控细胞周期影响AE+ AML细胞增殖。
**3. DHX15调控AE和AE9a转录本表达水平**
在169例AE+ AML临床样本中，DHX15 mRNA水平与AE9a和AE均呈正相关（AE9a: p<0.0001; AE: p=0.0098），但与AE9a/AE比值无明显相关。在Kasumi-1和SKNO-1细胞中，DHX15敲低显著下调AE和AE9a表达，而DHX15恢复实验显示AE9a mRNA的恢复程度高于AE。蛋白水平仅检测到AE蛋白下调与恢复，可能由于AE9a蛋白丰度低。但结果仍表明DHX15与AE9a转录本存在密切关系。
**4. HNRNPL和RBM33与AE9a转录本高度相关**
GSEA分析显示DHX15敲低后剪接相关通路和AE靶基因集显著下调。RIP实验在Kasumi-1细胞中检测到AE和AE9a mRNA存在于DHX15沉淀复合物中，表明DHX15可能结合AE前体mRNA。RNA pull-down使用AE、AE9a-short（非天然）和AE9a（全长）转录本进行体外结合分析，Western blot和质谱均未在RNA结合蛋白复合物中检测到DHX15，提示DHX15与这些转录本的相互作用可能是间接或弱的。质谱鉴定出21种蛋白特异性富集于AE9a组，包括HNRNPL、RBM14、RBM33、SF3A2和SRSF4等。在69例AE+ AML样本中，AE9a表达与RBM33和HNRNPL呈强正相关，与SRSF4呈负相关。AE与HNRNPL、RBM33、SF3A2呈双向关系：低AE表达时正相关，高AE表达时负相关。在Kasumi-1细胞中敲低HNRNPL或RBM33均导致AE9a和AE表达下降，提示HNRNPL和RBM33在AE9a表达中发挥独特作用。
**5. DHX15–HNRNPL–RBM33复合物的三维结构预测**
TCGA数据分析和自身队列均显示HNRNPL和RBM33高表达也预测AML不良预后。在69例临床样本、TCGA AML队列和1517种DepMap肿瘤细胞系中，DHX15、HNRNPL和RBM33的表达呈一致正相关。通过ColabFold进行的蛋白-蛋白相互作用预测和三维结构建模显示，RBM33的G-patch结构域（一个非结构化序列带有短N端α-螺旋）跨越DHX15的RecA2结构域，HNRNPL和RBM33的RNA识别基序(RRM)结构域定位在DHX15的Ratchet和OB结构域附近。这些模型为理解DHX15、HNRNPL和RBM33之间的关联提供了结构框架。
**讨论与结论**
讨论部分指出，AE+ AML约占所有AML病例的15%，是常见的染色体异常。本研究进一步定义了DHX15、AE和AE9a在AE+ AML中的表达模式和功能关系，揭示了DHX15在生成致癌性AE9a剪接变体中的先前未被认识的作用。临床和细胞实验一致表明DHX15高表达预示不良预后，DHX15敲低降低AE和AE9a表达并在体内抑制肿瘤生长。但AE9a强制表达能否挽救DHX15缺失导致的表型缺陷仍有待确定。DHX15传统上参与剪接体解聚，近期研究扩展到早期剪接体组装和剪接质量控制。RIP显示DHX15与AE和AE9a转录本结合，但RNA pull-down未一致检测到DHX15，提示可能间接或瞬时相互作用。质谱鉴定出HNRNPL和RBM33优先富集于含AE9a的转录本，且与AE9a正相关，支持它们参与调控AE9a丰度。HNRNPL含有四个RRM结构域，RBM33含有一个G-patch和一个RRM结构域，其生物学功能尚不完全清楚。结构模型预测了DHX15、HNRNPL和RBM33之间的空间邻近性。研究局限性在于缺乏对DHX15–HNRNPL–RBM33复合物的直接生化验证，未来需优化标记策略进行验证。除剪接外，DHX15还参与多种信号通路，本研究首次揭示DHX15显著影响AE+ AML细胞周期调控。总体而言，这些发现支持DHX15、HNRNPL、RBM33与AE9a剪接模式的关联，但无法排除转录共调控或间接效应，需要进一步机制研究确认直接分子相互作用和因果剪接调控。
研究结论翻译：总之，本研究提供了关于DHX15与AE9a剪接模式关联的见解，并强调了在AE+ AML中一个涉及DHX15、HNRNPL和RBM33的潜在RNA加工网络。鉴于AE9a在AML进展和预后中的临床相关性，DHX15相关通路可能代表未来治疗探索的一个潜在领域，但尚需进一步的机制验证。
