组蛋白去乙酰化酶抑制剂，辛二酰苯胺异羟肟酸，在基于人类干细胞的缺血性脑卒中模型中恢复血脑屏障完整性

《British Journal of Pharmacology》：The histone deacetylase inhibitor, suberoylanilide hydroxamic acid, restores blood–brain barrier integrity in a human stem cell-based model of ischaemic stroke

　　

背景与目的：缺血性脑卒中（ischaemic stroke）的特征是急性脑血管闭塞、血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）破坏以及狭窄的治疗恢复时间窗。由于再灌注损伤的风险和溶栓治疗的有限疗效，其治疗面临临床挑战；因此需要新的治疗方法。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitors, HDACi）已在卒中模型中显示出神经保护作用，但其对保护BBB完整性的影响尚未被探索。研究人员的目的是研究HDACi辛二酰苯胺异羟肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA）在缺血性脑卒中细胞培养模型中对BBB变化的影响。实验方法：在正常氧条件下，经过6小时氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation, OGD）和24小时再氧合（reoxygenation, OGD/R）后，测试SAHA对人BBB共培养模型的影响。主要结果：SAHA处理改善了OGD/R诱导的BBB完整性丧失，表现为跨内皮电阻增加和BBB通透性降低。参与细胞增殖的基因表达减少，而基底膜蛋白、糖萼合成酶和Wnt信号相关基因的表达增加。SAHA处理提高了claudin-5蛋白表达，并观察到从糖酵解到有氧呼吸的代谢转变。结论与意义：研究人员的结果表明，SAHA可能通过保护BBB成为治疗缺血-再灌注损伤的潜在辅助治疗药物。由于SAHA已经作为抗癌药物伏立诺他（vorinostat）获准用于人类，其重新用于恢复BBB功能和预防卒中后损伤可能大大促进。

缺血性脑卒中（ischaemic stroke）是全球致死和致残的主要原因之一，其主要病理特征为急性脑血管闭塞导致血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）破坏，而现有溶栓疗法治疗窗口窄且存在再灌注损伤风险，临床亟需新策略。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitors, HDACi）在卒中模型中具神经保护作用，但针对BBB的直接保护机制尚未阐明。为探究HDACi辛二酰苯胺异羟肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA）对BBB的保护作用，研究人员利用基于人脐血CD34⁺造血干细胞分化的脑内皮细胞（hEC）与牛脑周细胞建立BBB共培养模型。通过6小时氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation, OGD）后24小时再氧合（OGD/R）模拟缺血再灌注损伤，在再氧合阶段给予3 μM SAHA处理。论文发表于《British Journal of Pharmacology》，其重要意义在于揭示了SAHA通过增强BBB完整性和诱导代谢重编程来保护脑内皮细胞的机制，且因SAHA（伏立诺他）已是FDA批准的抗癌药，其老药新用前景广阔。

研究人员为开展研究采用的关键技术方法包括：（1）利用人脐血CD34⁺造血干细胞来源的脑内皮细胞（hEC）与牛脑周细胞建立非接触共培养的BBB模型；（2）通过跨内皮电阻（transendothelial electrical resistance, TEER）和示踪分子（荧光素钠SF、伊文思蓝-白蛋白复合物EBA）表观渗透系数（P_app）评估屏障功能；（3）采用基于cDNA末端大规模分析测序（massive analysis of cDNA ends sequencing, MACE-seq）进行全基因组基因表达谱分析；（4）利用超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）进行代谢组学分析；（5）通过免疫荧光染色和Western blot检测claudin-5等蛋白表达，并利用Cellpose软件分析细胞形态。

研究结果分述如下：
3.1 SAHA通过增强屏障功能保护BBB免受OGD/R损伤：在BBB共培养模型中，SAHA处理显著提高OGD/R后的TEER值（48.88 Ω×cm²），降低荧光素钠渗透率41%及EBA渗透率91%；免疫细胞化学和Western blot显示SAHA上调claudin-5蛋白表达，恢复其沿细胞边界的连续分布，并使细胞形态从球形（高圆度）恢复为更细长的纺锤形（高纵横比）。
3.2 SAHA对脑内皮细胞基因表达的影响：MACE-seq分析显示SAHA改变了18%的总基因集，其中BBB特异性基因中31%被调控。SAHA上调了基底膜形成相关基因（如FN1、RECK、SPOCK2）、糖萼合成酶基因（GALNT16）和Wnt信号基因（FZD4、FZD6），下调了增殖相关基因（MKI67）、炎症基因（IRAK1）及外排转运体基因（ABCG2/BCRP）。
3.3 SAHA增强内皮糖萼密度：免疫荧光显示SAHA显著增加WGA（识别唾液酸残基）和硫酸软骨素的荧光强度；MACE-seq显示糖萼合成酶基因（GALNT1、ST3GAL1、EXT2、ST8SIA6）上调；Zeta电位测量表明SAHA恢复OGD/R导致的表面负电荷降低，维持屏障功能。
3.4 SAHA将脑内皮细胞代谢从糖酵解转向有氧呼吸：代谢组学分析显示SAHA降低糖酵解中间产物（果糖二磷酸、二羟丙酮磷酸、甘油醛3-磷酸）水平，升高三羧酸循环（TCA cycle）代谢物（α-酮戊二酸、延胡索酸、苹果酸）水平，并调节糖核苷酸（UDP-葡萄糖、UDP-N-乙酰葡萄糖）含量。
3.5 SAHA增强基底膜相关蛋白的基因表达：MACE-seq发现SAHA上调层粘连蛋白10的三个亚基基因（LAMA5、LAMB1、LAMC1）、胶原基因（COL4A6、COL6A2等）和整合素受体亚基基因（ITGAV、ITGB1等），同时下调金属蛋白酶ADAMTS1、上调其抑制剂RECK。
3.6 SAHA处理在OGD/R期间下调细胞增殖：SAHA显著下调增殖相关基因（CDK17、TOP2A、MKI67等），免疫荧光显示Ki-67阳性细胞比例较OGD/R组明显降低，表明SAHA有效抑制OGD/R诱导的内皮细胞过度增殖。
3.7 SAHA对Wnt信号通路的影响：基因集富集分析（GSEA）显示SAHA显著富集非经典Wnt信号通路（β-连环蛋白非依赖性），而非经典Wnt/β-连环蛋白通路。SAHA上调Wnt受体基因（FZD2、FZD4、FZD6）及正调控因子，下调负调控因子（CTNNBIP1），且β-连环蛋白免疫荧光未见核转位，Western blot显示总β-连环蛋白水平无显著变化，提示非经典Wnt信号被激活。

讨论部分总结：研究讨论指出，SAHA通过上调claudin-5、增强糖萼和基底膜、诱导代谢转向有氧呼吸以及激活非经典Wnt信号，多途径恢复BBB完整性。其作为FDA批准药物的安全性资料可为后续开发更高效的中枢渗透性HDACi提供参考。研究结论部分翻译：综上所述，研究人员的发现表明，临床用作抗肿瘤药物的HDAC抑制剂SAHA能够在细胞培养模型中通过增强BBB功能保护脑内皮细胞免受缺血损伤。尽管SAHA的BBB渗透性低且为泛HDAC抑制剂（选择性一般），但在多项体内缺血研究中已显示神经保护功效。SAHA的优势在于作为FDA批准药物，具有可靠的人体安全性数据，这为聚焦于更佳中枢渗透性和亚型选择性的新型HDACi的药物开发提供了宝贵参考。基于研究结果，SAHA可作为一种有前景的辅助治疗手段，补充当前溶栓策略以治疗缺血后脑损伤。