《International Journal of Cancer》：Unraveling the Plasma Extracellular Vesicles Proteome: Predictors of Resistance in Immunotherapy of Advanced Melanoma
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尽管免疫检查点抑制剂（ICI）为晚期黑色素瘤患者带来了显著的临床获益，但由于频繁出现的治疗耐药，该疾病仍然具有挑战性。耐药可能是内在的（原发性）或随时间推移而出现（继发性）。目前尚缺乏能够在治疗前预测不同耐药表型的生物标志物。作为细胞通讯的关键介质，细胞外囊泡
尽管免疫检查点抑制剂（ICI）为晚期黑色素瘤患者带来了显著的临床获益，但由于频繁出现的治疗耐药，该疾病仍然具有挑战性。耐药可能是内在的（原发性）或随时间推移而出现（继发性）。目前尚缺乏能够在治疗前预测不同耐药表型的生物标志物。作为细胞通讯的关键介质，细胞外囊泡（EV）代表了有前景的生物标志物。本研究旨在鉴定与晚期黑色素瘤患者对ICI整体耐药、原发性耐药和继发性耐药相关的基线EV蛋白质组衍生通路和生物标志物，并推导出能够预测无进展生存期（PFS）的生物标志物组合特征。研究人员采用尺寸排阻色谱法和超速离心法从46例晚期黑色素瘤患者的治疗前血浆样本中分离EV。通过液相色谱-串联质谱联用技术（LC-MS/MS），使用基于神经网络的非数据依赖性采集（DIA-NN）进行蛋白质组学分析。利用Reactome、Metascape、Cytoscape和DAVID进行通路富集和网络分析。将耐药相关蛋白整合为复合生物标志物组合特征，并评估其与PFS的关联。整体耐药的特征是血小板和补体相关通路的富集。原发性耐药与Fcγ受体（FCGR）信号增强及KH型剪接调控蛋白（KSRP）相关转录后调控过程下调有关。相比之下，继发性耐药在基线时呈现出不同的EV蛋白质组模式，涉及补体激活以及止血和血小板相关通路的减少。针对整体、原发和继发性耐药的EV衍生生物标志物组合特征能够独立地区分患者的PFS。基线血浆EV蛋白质组学揭示了与晚期黑色素瘤对ICI的不同耐药表型相关的不同系统性生物学程序。EV衍生的生物标志物组合特征能够按PFS进行分层，并需要在更大的多中心队列中进行验证。
**血浆细胞外囊泡蛋白质组揭示晚期黑色素瘤免疫治疗耐药的预测因子**
**研究背景、问题与研究目的**
免疫检查点抑制剂（ICI）已成为晚期黑色素瘤的标准治疗，可为部分患者带来持久缓解。然而，约半数患者因耐药而无法获益。临床通常将耐药分为原发性（治疗初期即无应答或6个月内进展）和继发性（初始应答或稳定后进展）。目前，治疗前预测不同耐药表型的生物标志物严重缺乏。细胞外囊泡（EV）作为细胞间通讯的关键介质，其携带的蛋白质可能反映全身性免疫-代谢状态，具有作为液体活检标志物的潜力。鉴于临床迫切需要更好的生物标志物来指导个体化免疫治疗策略，本研究旨在探索血浆EV蛋白质组，以揭示晚期黑色素瘤ICI耐药的分子机制，并构建预测性生物标志物组合。
**研究人员开展的研究与结论**
研究人员开展了一项单中心回顾性研究，纳入46例来自汉堡大学皮肤癌中心（University Skin Cancer Center Hamburg）前瞻性生物样本库的接受免疫治疗的晚期黑色素瘤（AJCC III-IV期）患者。通过尺寸排阻色谱和超速离心从治疗前EDTA血浆中分离EV，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）结合基于神经网络的非数据依赖性采集（DIA-NN）进行蛋白质组学分析。通路富集和网络分析利用Reactome、Metascape、Cytoscape和DAVID等工具完成。通过单变量和多变量逻辑回归及Kaplan-Meier生存分析，研究人员鉴定出与整体、原发和继发性耐药相关的EV蛋白质组模式和生物标志物，并构建了预测无进展生存期（PFS）的复合标志物组合。研究得出以下结论：基线血浆EV蛋白质组学可区分不同耐药表型；整体耐药与血栓炎症（血小板激活、补体通路）特征相关；原发性耐药凸显Fcγ受体（FCGR）信号增强和KSRP介导的转录后调控下调；继发性耐药则表现为补体激活、抗原加工通路上调及止血/血小板通路下调。复合生物标志物组合（如IGHG3、APOC2等）能独立预测PFS。该论文发表在《International Journal of Cancer》。
**主要关键技术方法**
1. **EV分离与表征**：采用尺寸排阻色谱法（qEV2柱，70 nm孔径）联合超速离心（100,000 × g，70 min）从治疗前EDTA血浆中分离EV，并通过纳米颗粒追踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）确认粒径和纯度。样本队列来源于汉堡大学皮肤癌中心（University Skin Cancer Center Hamburg）前瞻性生物样本库，为单中心回顾性研究。
2. **蛋白质组学分析**：利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统（UHPLC结合Exploris 480质谱仪）在非数据依赖性采集（DIA）模式下进行蛋白质鉴定和定量，数据经基于神经网络的非数据依赖性采集（DIA-NN）算法处理，并通过批次效应校正（BERT算法）和样品中位数归一化。
3. **生物信息学与统计分析**：采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）区分组间蛋白质丰度模式；通过火山图筛选名义显著（p < 0.05，|log2倍变化| ≥ 1）的差异丰度蛋白（DEP）；利用Reactome、KEGG、WikiPathways等数据库进行通路富集分析和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建（Cytoscape/Metascape）。通过单变量和多变量逻辑回归及Cox比例风险模型评估蛋白质与耐药及PFS的关联；Kaplan-Meier分析用于评估复合生物标志物组合特征的预后分层能力。
**研究结果**
**3.1 患者特征**：46例患者中，31例出现整体治疗耐药（O-RST），其中20例为原发性耐药（P-RST，6个月内进展），11例为继发性耐药（S-RST）。非耐药患者（NON-RST）为完全缓解、部分缓解或稳定>6个月无进展者。中位随访时间约27.8个月（耐药组）和49.5个月（非耐药组）。各组间黑色素瘤亚型、ECOG状态、BRAF突变、LDH水平等临床特征均衡分布。
**3.2 EV分离与整体数据表征**：NTA显示各组EV粒径分布相似，约130 nm；TEM确认EV存在和纯度。蛋白质组学鉴定出2108种蛋白，其中1330种（63.1%）为三组共有。两组PLS-DA显示耐药组与非耐药组基线蛋白质组谱可区分；三组PLS-DA显示非耐药、原发耐药和继发耐药患者具有独特的基线丰度模式。火山图分析显示，校正多重检验后无蛋白达到统计显著性，因此后续使用名义显著（p < 0.05，|log2倍变化| ≥ 1）的蛋白进行分析。在非耐药组中，16种候选蛋白丰度显著降低，13种显著升高。
**3.3 整体耐药机制及预测性生物标志物提取**：通过Metascape通路富集分析，整体耐药组显著富集血小板激活、信号和聚集通路（FDR校正后）。关键贡献蛋白包括CDC42、ORM1、ALB、CAP1、HPX和RAC2。Cytoscape网络分析进一步突出免疫调节、炎症、止血和血小板激活通路。多变量逻辑回归显示，IGHG3（OR 2.43，95% CI 1.14–5.15，p = 0.021）和IGKC（OR 2.03，95% CI 1.05–3.91，p = 0.034）基线水平升高与整体耐药风险增加独立相关；而APOC2（OR 0.30）、APOC3（OR 0.16）和HIST1H4A（OR 0.43）与整体耐药风险降低独立相关。
**3.4 原发性耐药机制及潜在预测性生物标志物提取**：火山图分析筛选名义显著蛋白。Reactome通路富集显示，原发耐药组中中性粒细胞脱颗粒、补体级联激活和Fcγ受体（FCGR）信号显著上调，而KH型剪接调控蛋白（KSRP）介导的mRNA去稳定化通路下调。多变量逻辑回归显示，IGHG3（OR 4.19，95% CI 1.22–14.37，p = 0.022）和IGKC（OR 6.00，95% CI 1.30–27.71，p = 0.022）基线水平升高与原发耐药风险增加独立相关；APOC2（OR 0.38，95% CI 0.16–0.86，p = 0.027）水平升高与风险降低相关。
**3.5 继发性耐药机制及潜在预测性生物标志物提取**：与原发性耐药分析相似，继发耐药组上调通路主要为先天性免疫和髓系相关过程，包括中性粒细胞脱颗粒、吞噬溶酶体活性、炎症小体信号以及抗原加工（泛素化、蛋白酶体降解、ER-吞噬体交叉呈递）。下调通路以止血和血小板相关生物学过程为主，以及脂质和脂蛋白代谢。单变量和多变量逻辑回归显示，APOC1（OR 0.23，95% CI 0.05–0.59，p = 0.047）基线水平升高与继发耐药风险降低独立相关。
**3.6 预测性生物标志物组合计算**：基于上述分析构建复合生物标志物组合。Kaplan-Meier分析显示，整体耐药标志物组合（IGHG3、APOC2、APOC3、HIST1H4A、IGKC、APOC1）低分为高风险（中位PFS 6.4个月 vs 未达到）；原发耐药标志物组合（IGHG3、IGKC、APOC2）高分为高风险（中位PFS 4.6个月 vs 未达到）；继发耐药仅APOC1单标记（低分）为高风险（中位PFS 11.6个月 vs 未达到）。多变量Cox回归确认这些标志物组合独立预测疾病进展（整体耐药：HR 4.39，95% CI 1.73–11.14，p = 0.002；原发耐药：HR 5.74，95% CI 1.66–19.84，p = 0.005；继发耐药：HR 8.76，95% CI 1.37–55.66，p = 0.021）。
**讨论与结论总结**
研究表明，基线血浆细胞外囊泡（EV）蛋白质组学可捕捉与晚期黑色素瘤免疫检查点抑制剂（ICI）耐药相关的系统性生物学程序。整体耐药和原发性耐药的特征是血栓炎症（补体和血小板通路）及Fc依赖的先天性免疫信号；而继发性耐药在基线时呈现出不同的模式，涉及抗原加工、补体激活、代谢通路及血小板相关信号改变。将EV衍生蛋白整合为生物标志物组合，能够按无进展生存期（PFS）对患者进行分层，彰显了基于EV蛋白组学的液体活检在早期耐药评估中的潜力。尽管为探索性研究，这些发现为未来的验证研究提供了机制框架，并强调了基线全身性免疫-代谢状态在塑造免疫治疗结局中的重要性。研究结论为：基线血浆细胞外囊泡蛋白质组学揭示了与晚期黑色素瘤对ICI的不同耐药表型相关的不同系统性生物学程序。EV衍生的生物标志物组合特征能够按PFS进行分层，并需要在更大的多中心队列中进行验证。
