《Cell Research》：A universal 6iL/E4 culture system for deriving and maintaining embryonic stem cells across mammalian species
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在各哺乳动物物种中衍生真实的胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESCs）仍是一项重大挑战。在此，研究人员报道了一种定义的、无血清的培养体系，称为6iL/E4，其能够在多种哺乳动物物种中实现ESCs的衍生和长期自我更新。通过对信号通路的系统
在各哺乳动物物种中衍生真实的胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESCs）仍是一项重大挑战。在此，研究人员报道了一种定义的、无血清的培养体系，称为6iL/E4，其能够在多种哺乳动物物种中实现ESCs的衍生和长期自我更新。通过对信号通路的系统剖析，研究人员鉴定了涉及GSK3α、WNT、STAT3、PDGFR和MEK/ERK信号的保守调控模块。优化后的6iL/E4条件支持从小鼠、大鼠、兔和牛胚胎中稳定衍生和扩增ESCs。对于兔，ESC衍生需要补充LATS抑制剂TDI-011536（TDI），且6iL/TDI培养的兔ESCs表现出形成嵌合体的能力。在牛ESCs中，Klf2和Nanog的诱导表达增强了多能性并促进体内嵌合体贡献。重要的是，研究人员证明6iL能稳健地建立并维持人类多能干细胞处于na?ve样状态。这些发现揭示了不同哺乳动物物种间ESC自我更新的保守原理，并为跨物种干细胞研究、疾病建模和生物技术应用提供了一个通用平台。
研究背景与问题提出
哺乳动物胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells, ESCs）源自植入前胚胎的内细胞团（Inner Cell Mass, ICM），具备无限自我更新及分化为所有体细胞和生殖细胞谱系的能力。目前，仅有小鼠和大鼠成功建立了具有种系传递能力的真实ESCs，而其他哺乳动物物种尚未实现具备严格功能标准（尤其是嵌合体与种系贡献）的ESCs衍生。传统的2i（PD0325901抑制MEK1/2及CHIR99021泛抑制GSK3）或2i/LIF系统虽在啮齿类动物中成效显著，但在非啮齿类哺乳动物中无法稳健支持真实ESCs的建立，以往报道的兔和牛细胞系多被描述为“ES样”细胞，缺乏嵌合能力。此外，N2B27基础培养基成分复杂，可能促进神经分化从而不利于多能性维持。不同物种对WNT/β-catenin信号响应存在差异（如泛GSK3抑制在人中诱导分化），反映了环境依赖的通路调控差异。鉴于此，研究人员假设ESC自我更新的核心调控逻辑在进化上保守，旨在通过精确靶向保守信号通路建立通用培养体系，解决非啮齿类ESCs衍生难题，并揭示跨物种多能性调控的保守原理。该研究发表于《Cell Research》。
主要关键技术方法
研究人员采用了系统性的信号通路小分子抑制剂筛选与基础培养基成分重构策略，将N2B27简化为含胰岛素、转铁蛋白、牛血清白蛋白（BSA）及亚硒酸钠的E4培养基。利用小鼠、大鼠、兔（新西兰白兔）、牛（杂交肉牛）及人类（脐带血、WIBR3 hESCs）胚胎或细胞作为样本来源，结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）、批量RNA测序（RNA-seq）、全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）进行转录组与表观遗传分析。通过碱性磷酸酶（AP）染色、免疫荧光（IF）、核型分析评估多能性标志物与基因组稳定性。功能性验证包括体外拟胚体（EB）分化、体内畸胎瘤形成及嵌合体实验（小鼠、兔胚胎注射与牛胚胎移植）。针对特定物种优化引入LATS抑制剂TDI-011536（TDI）及可诱导Klf2/Nanog过表达系统，并利用CRISPR/Cas9进行基因编辑验证兼容性。
研究结果
Development of a defined 6iL/E4 culture system for rabbit and bovine ESC derivation
研究人员通过将N2B27重构为仅含四种核心成分的E4培养基（DMEM/F12与Neurobasal混合，补加胰岛素、转铁蛋白、BSA、亚硒酸钠），消除了促分化添加剂。在E4基础上筛选小分子组合，发现选择性GSK3α抑制剂BRD0705联合坦克酶抑制剂IWR1优于泛GSK3抑制剂CHIR（后者在非啮齿类中致分化）。补充LIF与STAT3激活剂828后，引入CP673451（CP67）抑制PDGFR及GDC0879抑制BRAF，形成5iL条件。进一步加入SKL2001（非经典WNT/β-catenin机制）确立最终6iL（BRD0705, IWR1, CP67, GDC0879, SKL2001, 828, LIF）/E4体系。该体系支持牛与兔ICM外植生长及ESC衍生，撤除任一成分均破坏自我更新，且BRD0705替代CHIR为维持非啮齿类未分化的关键。
Stable and long-term maintenance of rodent ESCs in 6iL/E4
在6iL/E4中，小鼠ESCs（mESCs）与大鼠ESCs（rESCs）可长期维持（mESCs至P35，核型正常，AP阳性，均匀表达NANOG与OCT4）。scRNA-seq显示94.66%细胞为ESC群体，UMAP整合分析定位其介于E4.5与E5.5胚胎之间，与2i/LIF培养的mESCs重叠，低表达启动态（primed）标记Foxa2。功能上，6iL-mESCs可分化为三胚层（EB与畸胎瘤），GFP标记细胞广泛贡献于嵌合胚胎各胚层及E13.5性腺（表达NANOS3），并能衍生成胚胎生殖细胞（EGCs）。rESCs在6iL中维持典型形态与多能基因表达，PCA定位于早期上胚层，可逆回2i条件，且具备三胚层分化及原始生殖细胞样细胞（PGC-LCs）生成能力。
Generation and characterization of human PSCs in 6iL/E4
6iL/E4支持由脐带血细胞重编程获得的无整合hiPSCs及hESCs的长期扩增（至P27），无需ROCK抑制剂即可单细胞传代。细胞呈compact dome状，表达NANOG与OCT4，核型正常。scRNA-seq显示85.8%为na?ve样群（富集NANOG, DPPA4），14.2%为primed样群（CD47, NCAM1），整合分析接近t2iLGo培养的na?ve hESCs。PCA定位于人D8–D9胚胎区间，WGBS显示相对mTeSR培养的primed hiPSCs呈低甲基化趋势。条件转换实验表明6iL维持的na?ve样状态与mTeSR的primed状态不可互换。在携带ΔPE-OCT4-GFP与DOX诱导Klf2/Nanog的WIBR3 hESCs中，撤除DOX后6iL能维持GFP阳性及自我更新，而t2iLGo条件则在P3失效，证明6iL更优维持重置后的人多能性。
Hippo pathway modulation enables stable derivation of chimera-competent rabESCs under 6iL/E4
单纯6iL培养的兔ESCs（rabESCs）约P10出现分化，补充Hippo通路LATS1/2抑制剂TDI或TRULI（促进YAP核转位）显著提升AP?克隆数与长期稳定性（6iL/TDI）。桑椹胚来源的rabESCs衍生效率高于囊胚，维持正常核型（2n=44）及三胚层分化能力，生成PGC-LCs。GFP标记6iL/TDI-rabESCs注射入8细胞兔胚胎，发育至囊胚呈高嵌合度；139枚注射胚胎移植获16只存活幼崽，其中1只（R644-4）PCR与Western blot证实GFP?，卵巢组织检出GFP?细胞，证明具嵌合能力。亦成功利用CRISPR/Cas9生成Tyr编辑的rabESCs。
Derivation and characterization of 6iL-bESCs
6iL/E4高效衍生牛ESCs（bESCs）并维持超35代，表达NANOG与OCT4。相较AFX（Activin A, FGF2, XAV939）培养的细胞，6iL-bESCs高表达Nanog, Pou5f1, Rex1等而低表达Otx2；PCA显示其转录组定位于早期囊胚阶段，较bEPSCs更接近正常囊胚轨迹。具备三胚层分化与正常核型（2n=60）。引入DOX诱导Klf2/Nanog系统增强克隆致密性与Pluripotency基因（Pou5f1, Esrrb）表达，撤除DOX后仍可分化为PGC-LCs（PRDM1/NANOS3双阳）。GFP标记诱导系注射入8细胞、桑椹胚及囊胚，分别获50%–68% GFP?囊胚；移植后获E40嵌合胎，约18.2% GFP贡献度，分布于中内胚层。亦完成Prnp编辑的bESCs构建。
讨论部分总结与研究结论翻译
讨论部分指出，6iL/E4作为定义的无血清平台，通过简化E4基底与模块化6iL信号鸡尾酒（选择性GSK3α抑制、WNT调制、PDGFR/MEK/ERK抑制、STAT3激活及Hippo/YAP调控），揭示了多能性维持依赖保守但定量可调的信号架构而非物种特异路径替换。BRD0705选择性抑制GSK3α（非经典β-catenin激活）是跨物种关键，CHIR致非啮齿类分化；PDGFR抑制（CP67）限制原始内胚层（PrE）分化以利ICM来源ESC捕获；STAT3具跨物种重要性；Hippo/YAP调控在特定信号背景下增强增殖但非普适；SKL2001具非经典机制。物种差异如缺乏胚胎滞育（diapause）致非啮齿类ESC难捕获，可通过信号微调与Klf2/Nanog强化克服。局限包括兔长期培养偶发分化、牛尚需优化无外源因子维持、生殖系传递待证及转录态非完全等同小鼠ground state。
研究结论翻译如下：研究人员提出了一种定义的、无血清的6iL/E4培养平台，能够从多种哺乳动物物种（小鼠、大鼠、兔和牛）衍生并长期扩增ESCs，并支持na?ve样人PSCs。通过系统解构基底培养基组成与重建信号输入，证明共享的可调信号架构能稳定跨物种多能性。这些发现支持ESC自我更新底层调控逻辑广泛保守的观点，尽管通路输出与定量需求存物种差异。E4的简化消除促分化活性，提供清晰交叉探究平台；6iL模块化结构表明多能性可通过平衡保守信号输入（WNT调制、选择性GSK3α抑制、抑制PDGFR与MEK/ERK、STAT3激活）维持，无需根本不同的物种特异路径。Hippo/YAP调制与PDGFR抑制是非啮齿类高效衍生关键。该工作为大型动物基因工程与跨物种多能性研究提供概念证据，表明尽管系统发生、胚胎发生与体型差异巨大，ESC多能性核心调控回路保守。
