老年小鼠脑白质衰老与疾病相关小胶质细胞的空间定位及senolytic靶向干预

《Nature Aging》：Spatial mapping and senolytic targeting of senescent and disease-associated microglia in aged mouse brain white matter

　　

脑白质在结构与功能上发生的改变与晚年认知下降密切相关，但其选择性易损的细胞与分子基础尚未完全明确。研究人员在自然衰老小鼠中发现，衰老与疾病相关小胶质细胞（disease-associated microglia, DAM）表型在海马邻近白质尤其是穹窿伞（fimbria）中汇聚。通过区域基因表达谱分析、免疫标记、GeoMx数字空间图谱（digital spatial profiling, DSP）与CosMx空间分子成像（spatial molecular imaging, SMI），研究人员鉴定出一个定位于白质、仅在老龄脑中出现的微胶质细胞群，其共同表达DAM基因与包括半乳糖凝集素?3（galectin?3, GAL3/Lgals3）在内的“SenBrain”衰老基因特征。单细胞空间轨迹分析提示，多种细胞命运转换可能产生这种兼具衰老与DAM关联的老年、促炎状态。药理遗传学或药理学senotherapeutic干预降低了白质中GAL3+DAM的丰度，并使老年穹窿伞中的小胶质细胞组织恢复至更年轻的状态。这些发现确定了一种富集衰老与DAM特征的微胶质细胞状态，是老年脑白质显著且部分可逆的特征。

研究背景方面，衰老会增加认知下降与神经退行性疾病的风险，但导致脑区特异性功能障碍的细胞与分子级联事件仍不清楚。海马结构是介导学习记忆的衰老易感区，其皮质灰质直接与致密白质束如胼胝体及穹窿伞（fimbria-fornix）相邻，作为Papez环路的核心组分参与记忆与情绪功能。影像研究表明，白质功能障碍特别是穹窿伞的改变可能早于皮质灰质功能障碍，是认知衰退进程中记忆受损的早期皮层边缘损伤表现。细胞特异性分子介质是维持脑健康与预防衰老相关神经病理发生的潜在干预靶点，炎症与衰老命运是衰老组织中出现的适应性不良细胞轨迹。在衰老与神经退行性脑中，疾病相关小胶质细胞（DAM）积聚并表现为稳态基因下调伴随神经炎症、溶酶体应激及神经退行相关基因上调，APOE-TREM2通路是DAM样小胶质细胞的关键调节因子。白质小胶质细胞相对于灰质小胶质细胞发挥重叠且不同的作用，白质相关小胶质细胞（white matter-associated microglia, WAM）被鉴定为依赖TREM2且在衰老中增加的人群。已有表征显示DAM与衰老表型重叠，衰老DAM表达周期蛋白依赖性激酶抑制剂（Cdkn）、趋化因子、促存活因子、经典DAM因子及溶酶体应激因子，其中GAL3/Lgals3是既定的小胶质细胞因子，与神经炎症受体相互作用、参与吞噬重塑并与适应不良及疾病状态相关。现有研究缺乏在保留解剖组织背景下对衰老与DAM小胶质细胞身份的高维空间定位表征，且白质作为衰老易感焦点的细胞机制尚未明确，因此研究人员开展本研究以在自然衰老小鼠中海马邻近灰质与白质的易损皮层边缘区探究衰老与DAM小胶质细胞身份，并评估senotherapeutic靶向的效果与意义。该研究发表于《Nature Aging》。

研究人员为开展研究使用的主要关键技术方法包括：在自然衰老雌性及雄性C57BL/6小鼠与p16-InkAttac小鼠中，对显微分离的穹窿伞?胼胝体白质与海马灰质进行实时聚合酶链反应（RT?PCR）区域基因表达分析；进行免疫荧光成像以检测GAL3、IBA1、APOE等蛋白的空间分布与共定位；采用成像质谱流式（imaging mass cytometry, IMC）以金属同位素偶联抗体在约1微米空间分辨率下定量海马与穹窿伞髓样细胞衰老及DAM蛋白标志物；使用GeoMx数字空间图谱（DSP）基于蛋白标记正负选择感兴趣区域并进行全转录组探针杂交与测序分析；运用CosMx空间分子成像（SMI）结合自定义50基因衰老相关面板与950?plex小鼠神经科学面板在单细胞分辨率下对海马、胼胝体、穹窿伞、皮质、背侧丘脑及脉络丛进行空间转录组分析；通过Leiden聚类、UMAP降维、Monocle3轨迹推断与Harmony批次校正进行生物信息学细胞亚群与轨迹分析；对老年小鼠施行药理遗传（AP20187诱导p16^InkAttac细胞清除）与药理学（venetoclax抑制BCL2）senotherapeutic干预，并评估白质基因表达与小胶质细胞形态学变化。

研究结果部分依次如下。

Expression of DAM and senescence genes, including p16^ink4aand Lgals3, increase in aged brain white matter：研究人员通过对老年雌性与雄性小鼠显微分离的穹窿伞?胼胝体白质及海马组织进行RT?PCR分析，发现p16^ink4a、Cdkn2a、Lgals3、Cdkn1a/p21、Ccl2、Ccl5、Apoe、Gpr34等衰老与DAM相关基因在白质中的表达显著高于海马，且与年轻同类相比，老年雌雄小鼠灰质与白质中上述基因均升高，其中穹窿伞?胼胝体白质中的增加更为一致与显著，表明白质在衰老晚期易发生衰老与DAM转录特征改变。

GAL3⁺myeloid cells accumulate in the hippocampal-adjacent white matter of old mice：研究人员通过免疫荧光成像发现，GAL3⁺细胞在年轻小鼠脑中罕见，而在老年小鼠多个边缘区尤其穹窿伞白质中密集定位，且与小胶质细胞/髓样标记IBA1共定位而不与星形胶质细胞标记GFAP共定位；老年雌性穹窿伞中IBA1⁺GAL3⁺细胞大于IBA1⁺GAL3^?细胞，形态学PCA可区分二者，前连合与胼胝体白质也显示强GAL3⁺免疫活性，表明衰老白质中GAL3/Lgals3这一衰老与DAM标记物增加，且在老年雌性中更明显。

IMC demonstrates microglia positive for senescent and DAM markers are abundant in the aged fimbria：研究人员通过IMC在老年雌性小鼠海马与穹窿伞检测IBA1、CX3CR1、GAL3、CD38、uPAR等10种蛋白，发现穹窿伞髓样细胞IBA1、GAL3、CD38、uPAR、dPP4、CD45强度高于海马髓样细胞，而海马CX3CR1更高；穹窿伞中GAL3⁺细胞较GAL3^?细胞趋向性或显著性更高表达uPAR与CD38等衰老相关标记，从蛋白水平验证老年穹窿伞积聚含GAL3与uPAR在内的衰老与DAM标记。

GeoMx DSP confirms enrichment of conserved DAM and expanded gene signatures in aged fimbria white matter：研究人员借助GeoMx DSP以GAL3、IBA1、SYTO83为正选、GFAP为负选分割海马与穹窿伞区域，比较发现穹窿伞IBA1⁺细胞富集Fth1、Ctss、Apoe及候选衰老基因Ccno、Sesn3，而海马IBA1⁺细胞富集其他基因；在老年穹窿伞内比较IBA1⁺GAL3⁺与IBA1⁺GAL3^?小胶质细胞，Apoe在IBA1⁺GAL3⁺细胞中表达最高，证实老年穹窿伞小胶质细胞经典DAM与新增基因签名均增加。

CosMx SMI reveals diverse aged microglial identities, including white matter-concentrated DAM- and senescence-linked states：研究人员利用CosMx SMI在老年雌性小鼠多脑区以自定SenBrain面板联合神经科学面板分析，鉴定出2620个微胶质细胞分为9群，其中集群1、2、4、7、9比例富集于穹窿伞与胼胝体白质；白质定位微胶质细胞富集少突胶质细胞转录本Mbp、Mobp、Plp1，灰质定位者富集神经元转录本，提示微环境邻近性；不同集群具独特与共享签名，集群7含最高频Lgals3⁺细胞并高表达多种DAM与衰老相关基因，SenBrain模块评分最高，且在细胞周期调控、核应激、SASP、SCAP、细胞器应激与细胞表面标记等衰老域均显著富集，从而描绘出白质富集、共表达DAM与衰老基因的微胶质细胞状态。

Young versus old CosMx spatial maps reveal age-altered, white matter-enriched microglia：研究人员通过比较年轻与老年雌性小鼠CosMx数据，自1116个年轻与1811个老年微胶质细胞获15个集群，其中集群3、10、15在年轻脑中罕见或缺失；集群10高表达Apoe、Axl、B2m、Clec7a、Ctsb、Ctsd、Gpnmb、Lgals3、Spp1等DAM与衰老基因，与前述集群7重叠，且主要定位于白质；SenBrain评分以集群10最高，其在SASP、细胞器应激、细胞表面域富集明显，Lgals3表达最突出；轨迹分析显示自稳态集群1经集群13、3可向集群10转变，亦可自集群10逆行分出多支，提示衰老DAM状态可能沿多条分子轨迹产生，最终在老年白质形成高炎症SenBrain高评分群体。

Senotherapeutics blunt age-related senescence and DAM gene expression in white matter：研究人员在老年p16-InkAttac小鼠中以AP20187清除p16^ink4a阳性细胞或以venetoclax抑制BCL2，发现AP20187降低雌性穹窿伞?胼胝体白质与海马中p16^ink4a表达，AP20187与venetoclax均降低雌性白质中年龄增加的Lgals3，AP20187还降低Trem2、Tmem173、Tyrobp在雌性白质的表达，雄性响应较异质，表明系统性靶向衰老细胞可削减老年白质衰老与DAM标记基因表达。

Senotherapeutics restore aged fimbria microglial morphology, identity and abundance to a more youthful state：研究人员对同一半球切片进行IBA1免疫荧光定量，发现老年穹窿伞IBA1⁺细胞密度与面积大于年轻，呈纺锤或变形虫形态；AP20187将IBA1⁺密度恢复至年轻水平，AP20187与venetoclax均减小细胞面积，并将微胶质细胞长轴与纤维束夹角偏移恢复至年轻样分布；形态学主成分分析显示老年对照与年轻、给药组分离，AP20187与venetoclax处理使形态属性部分回退至年轻状态，但在年轻脑中两药影响模式不同，说明p16或BCL2靶向在老年与年轻脑对微胶质细胞的作用各异。

Senotherapeutics revert age-altered GAL3⁺and APOE⁺cell abundance and organization in the fimbria：研究人员进一步染色GAL3与APOE发现，老年对照雌性穹窿伞GAL3⁺面积占比与IBA1⁺GAL3⁺频率高于年轻，AP20187或venetoclax减少GAL3⁺面积与IBA1⁺GAL3⁺频数，AP20187降低剩余IBA1⁺GAL3⁺细胞荧光强度；APOE⁺细胞在老年白质高密度且与GAL3共定位，老年荧光强度更高，两药均降低APOE信号、APOE⁺与IBA1及GAL3共定位百分比，并改变APOE⁺细胞距穹窿伞中线的分布使之更分散，综合显示senotherapeutic使老年穹窿伞微胶质细胞分子与组织属性恢复至更年轻状态。

讨论部分总结：研究人员指出白质完整性是神经元活动与认知功能的关键决定因素，小鼠与人类中白质束在衰老中选择性易损，而适应性不良、小胶质细胞介导的神经炎症正成为潜在驱动因素。通过成像、基因表达与空间分子图谱，研究人员绘制了年轻与老年微胶质细胞图谱，揭示仅在老年出现的富集SenBrain与DAM签名的群体，即DAM senotype（衰老表型），其集中于白质但可能源自白质或灰质不同命运轨迹；GAL3/Lgals3是老年白质关键衰老与DAM关联生物标记，系统性靶向p16或BCL2可部分恢复老年白质微胶质细胞身份与组织至年轻态。IMC、GeoMx DSP、CosMx SMI各有优劣但共同避免了单细胞解离假象并在保留内源性分子状态下刻画了区域定义分子改变与细胞互作。AP20187降低白质与灰质p16^ink4a及相关DAM标记，但Cdkn2a在CosMx中低检测需注意方法局限，BCL2靶向降低DAM标记但不影响Cdkn2a/p16^ink4a，且两药在年轻脑引起不同微胶质细胞反应，说明senolytic在非衰老机体亦有影响；药物穿透老化脑区及间接作用于脑实质外细胞的问题尚需细胞特异性干预与微胶质细胞耗竭研究来阐明。轨迹推断提示稳态微胶质细胞迁移至特定生态位获DAM表型后再激活衰老程序、区域持续应激渐进改变常驻微胶质细胞、或白质常驻与脑室边界微胶质细胞传递外周信号激活DAM与衰老通路等多种可能，具体权重因亚区而异，如穹窿伞更易受脑脊液与脉络丛免疫互作影响。持续髓鞘与碎屑清除致溶酶体过载及GAL3累积可能推动DAM由适应性转向衰老适应不良，Spp1等SASP因子在老年DAM/WAM中抗拒耗竭并招募CD8⁺T细胞促白质退变，而清除p16⁺衰老小胶质细胞可减少脑内DAM样细胞与外周适应免疫细胞并保留认知。综上，研究人员通过多平台成像与分子方法证明衰老与DAM签名在老年白质小胶质细胞中显著，可能是认知下降的神经病理级联基础，而系统性BCL2或p16靶向可有效对抗该特征并部分逆转微胶质细胞分子与细胞组织至年轻状态。