《Journal of Inherited Metabolic Disease》：NAXD Deficiency: Heterogeneous Phenotypes and Positive Response to Niacin Treatment
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早发性进行性脑病伴脑水肿和/或白质脑病-2（PEBEL2）是一种罕见的常染色体隐性遗传神经代谢疾病，由NAXD中的致病性变异引起，其中发热性疾病或感染会触发快速临床恶化。研究人员描述了九例新病例，扩大了临床和分子谱系。四名儿童表现出典型的发热或疾病后严重神经功
早发性进行性脑病伴脑水肿和/或白质脑病-2（PEBEL2）是一种罕见的常染色体隐性遗传神经代谢疾病，由NAXD中的致病性变异引起，其中发热性疾病或感染会触发快速临床恶化。研究人员描述了九例新病例，扩大了临床和分子谱系。四名儿童表现出典型的发热或疾病后严重神经功能下降，并携带影响酶结构域的变异。四例病例呈现疾病触发的心脏功能障碍，与线粒体靶向序列（MTS）中的变异相关。一例病例出现严重的产前神经变性导致死产。两名患者的疾病发作发生在COVID-19感染之后。对五种错义变异的功能分析表明NAXD蛋白溶解度受损、NADHX脱水酶活性降低和/或热稳定性下降。患者成纤维细胞证实了受损辅因子（S-、R-和环状NADHX）的积累以及NAXD蛋白水平降低。比较蛋白质组学分析揭示了非典型心脏和产前病例与典型神经学表现相比的独特分子特征。四名患者接受了高剂量烟酸（维生素B3）治疗，并在反复发热发作中存活下来。这些发现支持早期识别，并提示烟酸治疗可能改善PEBEL2整个临床谱系的结果。
NAXD缺陷（NAD(P)HX脱水酶缺乏）是一种罕见的常染色体隐性遗传神经代谢疾病，称为进行性早发性脑病伴脑水肿和/或白质脑病-2（PEBEL2），由NAXD基因的致病性变异引起。该基因编码一种线粒体富集的修复酶，负责将受损的辅因子NAD(P)HX（S-、R-和环状形式）转换回功能性NAD(P)H。在发热或感染等应激条件下，受损辅因子积累，抑制脱氢酶活性，导致线粒体能量代谢障碍和核心代谢通路（如丝氨酸代谢）紊乱。目前，多数PEBEL2患者在轻微疾病后死亡，仅少数早期接受烟酸（维生素B3）治疗的患者存活，但烟酸疗效可能短暂甚至在高剂量时有毒。此外，基因型-表型关联逐渐显现：线粒体靶向信号（MTS）区域的变异主要与心脏/肌肉表型相关，而影响胞质和线粒体形式的变异则与神经炎症、癫痫和皮肤病变表型相关。然而，现有病例数量有限，对疾病谱系和治疗策略的理解仍不充分。
研究人员在《Journal of Inherited Metabolic Disease》上报告了9例新PEBEL2病例，进一步扩展了临床和分子谱系。通过分析，研究人员识别出三种不同的临床表型：神经学表型（4例，典型发热后神经恶化）、心脏表型（4例，MTS变异导致急性心脏功能障碍）和产前神经变性表型（1例，死产）。其中2例神经学患者在COVID-19感染后发病。功能基因组学表征（包括NAD(P)HX代谢组学、蛋白稳定性、酶动力学、定量蛋白质组学及通路分析）证实了NAXD变异的致病性。值得注意的是，4例接受高剂量烟酸治疗的患者在后续疾病发作中存活，表明烟酸治疗可能改善PEBEL2整个临床谱系的结果。
主要关键技术方法包括：1）从患者皮肤活检建立原代成纤维细胞培养（样本来源包括墨尔本皇家儿童医院等）；2）采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析细胞内NAD(P)HX代谢物水平（包括S-NADHX、R-NADHX和环状NADHX）；3）通过细菌重组表达和纯化胞质NAXD（cytoNAXD）蛋白，进行酶动力学（Michaelis-Menten方程拟合）和热稳定性测试；4）利用哺乳动物细胞（HEK293T和COS7）表达系统，结合Western blot和亚细胞分级分离，分析错义变异的蛋白溶解度及p.Met1?变异的线粒体定位；5）采用数据非依赖性采集（DIA）的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行定量蛋白质组学，结合MitoCarta3.0数据库注释和相对复合物丰度（RCA）分析，比较患者与对照成纤维细胞的蛋白质组变化。
**3.1 NAXD病例的临床和遗传描述**：通过分析9例新病例的临床特征和基因变异，研究人员发现4例（病例1-4）呈现典型神经学表型（发热后快速神经代谢恶化），携带导致联合NAXD（Combined NAXD）缺陷的变异；4例（病例5-8）呈现心脏表型（急性心脏功能障碍），其中病例5携带一个Mito NAXD等位基因，病例6-8携带纯合p.Met1?变异（起始密码子丢失），导致Mito NAXD缺陷；1例（病例9）呈现严重产前神经变性并死产，携带联合NAXD变异。纤维母细胞系（来自病例1、5、9）用于后续功能研究。
**3.2 成纤维细胞中NAD(P)HX积累**：通过LC-MS测量细胞内NAD(P)HX水平，发现与儿科对照成纤维细胞相比，病例1、5、9的S-NADHX和R-NADHX显著增加。联合NAXD缺陷病例（病例1和9）的积累倍数远高于心脏表型病例（病例5），后者因p.(Ala20Phefs*9)等位基因保留残余胞质NAXD活性。
**3.3 重组NAXD错义变异的酶动力学**：对p.(Arg250His)（病例1）、p.(Leu294Pro)（病例5）、p.(Ser235Phe)（病例9）及先前报道的p.(Pro103Leu)变异进行酶动力学分析。p.(Leu294Pro)和p.(Ser235Phe)因蛋白不溶性导致活性几乎不可检测；p.(Arg250His)和p.(Pro103Leu)保留显著残余活性，但热稳定性远低于野生型蛋白（<50%活性在30°C以上预孵育后丧失），支持发热诱发的临床发作。
**3.4 定量蛋白质组学**：对病例1、5、9的成纤维细胞进行全细胞定量蛋白质组学，并与5例先前报道的PEBEL2患者比较。在所有新病例中，NAXD是最显著下降的蛋白质之一（病例1：42%对照中位数；病例5：26%；病例9：9%）。RCA分析显示，病例1（神经学表型）的复合物I（92%）和复合物III（72%）丰度显著降低，而先前报道的神经学病例还涉及复合物IV和V下降。病例5（心脏表型）和病例9（产前神经变性）无显著OXPHOS下降，但病例5线粒体核糖体亚基增加，病例9复合物I和V增加。通路富集分析显示，先前神经学病例的差异蛋白涉及细胞外基质、糖异生、胆固醇生物合成和线粒体通路；心脏表型病例富集细胞周期和DNA修复，下调脂质代谢和先天免疫系统；产前病例上调代谢通路，下调细胞外基质组织。
**3.5 p.Met1?表达和细胞内定位分析**：通过构建C端FLAG标签的Mito NAXD表达载体，在COS7细胞和HEK293T细胞中证实，p.Met1?变异导致NAXD蛋白无法定位于线粒体，而是保留在胞质中，且分子量略小（可能起始于Met3），表明MTS丢失。
**讨论部分总结**：NAXD致病性变异主要与发热诱发的快速神经恶化相关，但MTS变异逐渐与心脏/肌肉表型关联。本报告进一步扩展了PEBEL2的临床谱系，包括心脏表型和产前神经变性。烟酸治疗在4例患者中显示存活益处，目前存活9例（包括先前报道），提示PEBEL2应被视为可治疗的线粒体疾病。然而，烟酸长期疗效和安全性尚需确定，且需注意避免NADHX过载。代谢组学分析证实NAD(P)HX积累，且联合NAXD缺陷病例积累更显著。定量蛋白质组学揭示心脏和产前病例具有独特的分子特征，与神经学病例不同。错义变异导致蛋白不稳定性或热稳定性降低，与发热触发临床发作一致。p.Met1?变异导致线粒体靶向失败，支持MTS截断变异与心脏表型的关联。
**研究结论部分翻译**：总之，提高对PEBEL2分子疾病机制以及变异对蛋白功能影响的理解，将提高这一超罕见疾病的诊断率。进一步增加复杂性的是PEBEL2临床表型的扩展，现在有更多证据支持心脏受累（9例患者，通常与MTS变异相关）。因此，考虑将NAXD纳入其他基因面板（如心脏、胎儿异常、成人发作性癫痫）具有重要价值，以促进更快速诊断并可能预防致命疾病结局。未来工作应聚焦于模拟这些不同的临床亚型，例如使用诱导多能干细胞（iPSCs）分化为疾病相关细胞类型。此外，斑马鱼或啮齿动物等整体动物模型将允许更全面的研究，为大脑和心脏等最脆弱组织的病理效应提供独特见解。这些模型还可用于研究外部刺激（如应激或炎症触发因素）如何加速疾病发展。更广泛地说，这些研究可加深对其他相关线粒体和代谢疾病的理解。
