神经束膜整合瘦素与其交感神经输出以预防肥胖

《Nature Metabolism》：The perineurium integrates leptin with its sympathetic outflow to protect against obesity

　　

瘦素（leptin）在大脑中的传入作用的调节机制依赖于白色和棕色脂肪组织的传出交感神经支配。然而，控制传入-传出平衡的外周调节仍不明确。在此，研究人员通过对小鼠交感神经节进行单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），展示了在脂肪组织中形成交感神经节和神经束屏障的神经束膜细胞（perineurial cells）中，瘦素受体（leptin receptor, Lepr）和β2-肾上腺素能受体（β2-adrenergic receptor, Adrb2）均有富集表达。Lepr⁺交感神经束膜细胞（sympathetic perineurial cells, SPCs）在分子上类似于内皮细胞。在Lepr⁺细胞（包括SPCs）中条件性敲除Adrb2，通过降低能量消耗和产热而不影响食物摄入，使雄性小鼠易患肥胖。值得注意的是，肥胖相关的高瘦素血症（hyperleptinaemia）导致SPCs凋亡，破坏神经束膜屏障并伴随脂肪交感神经病变。这种有害效应可通过部分降低瘦素或拟交感β2-肾上腺素能受体激动作用逆转。临床上，研究人员在大型欧洲人群中观察到LEPR和ADRB2多态性对体重指数风险增加的男性特异性协同效应。研究人员提出，SPCs协调瘦素作用的神经内分泌环路的传入和传出臂，以调节能量消耗和体重。

**论文解读**

**研究背景与问题**
瘦素（leptin）通过神经内分泌负反馈环路调节体重。该激素作为传入信号，由白色脂肪细胞按脂肪储量比例释放，作用于下丘脑神经元以抑制食物摄取并激活相应的下行传出交感神经活动，从而触发白色脂肪组织（white adipose tissue, WAT）的脂肪分解和棕色脂肪组织（brown adipose tissue, BAT）的产热。传出臂通过去甲肾上腺素能信号减少脂肪质量，进而降低瘦素水平，从而闭合环路。然而，调节传入瘦素与传出交感神经流出之间平衡的细胞和分子机制尚不清楚。现有研究主要集中在中枢食欲调控，而外周机制对环路平衡的影响仍不明确。

**研究开展与结论**
研究人员在小鼠交感神经节上进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），发现了一群高表达瘦素受体（Lepr）的内皮细胞，这些细胞构成围绕交感神经节和神经束的神经束膜屏障，称为交感神经束膜细胞（sympathetic perineurial cells, SPCs）。SPCs同时高表达β2-肾上腺素能受体（Adrb2），且这一共表达在多种外周器官中极其罕见，主要局限于交感神经节。通过条件性基因敲除实验，研究人员发现Lepr⁺细胞（包括SPCs）中敲除Adrb2可导致雄性小鼠能量消耗和产热降低、脂肪增加，且不依赖于食物摄入，从而引发肥胖。进一步研究表明，肥胖相关的高瘦素血症通过诱导SPCs凋亡，破坏神经束膜屏障，并导致脂肪交感神经病变。这一过程可通过部分降低瘦素或给予拟交感β2-肾上腺素能受体激动剂（如克伦特罗）逆转。临床队列分析显示，在大型欧洲人群（UK Biobank）中，LEPR和ADRB2的常见多态性（rs1137101和rs1042714）对男性体重指数（body mass index, BMI）增加存在男性特异性协同效应，与小鼠模型的性别二态性一致。研究提出，SPCs通过协调瘦素神经内分泌环路的传入（瘦素）和传出（去甲肾上腺素能）臂，调节能量消耗和体重。论文发表于《Nature Metabolism》。

**主要技术方法**
1. **单细胞RNA测序（scRNA-seq）**：对小鼠（C57BL/6）颈上神经节（superior cervical ganglia, SCG）和星状神经节（stellate ganglia）进行scRNA-seq，整合普食和高脂饮食（high-fat diet, HFD）喂养的雄性小鼠数据，使用Seurat进行聚类分析（分辨率0.5），UMAP降维。
2. **条件性基因敲除小鼠模型**：利用Lepr^Cre; Adrb2^fl/fl小鼠在Lepr⁺细胞中特异性删除Adrb2，通过代谢监测（Promethion系统）评估能量消耗、产热和活动，结合qPCR检测产热基因表达。
3. **体外外植体培养与药物处理**：分离小鼠SCG和星状神经节，进行24小时外植体培养，施加不同浓度瘦素（低10 ng ml^?1，高100 ng ml^?1）及β2受体激动剂（克伦特罗）或拮抗剂（布托沙明），通过免疫荧光定量CAV1和TH信号。
4. **RNAscope双原位杂交（ISH）与免疫组化**：在固定小鼠和人类组织上进行RNAscope检测Lepr和Adrb2 mRNA，结合GLUT1、CAV1或NeuN抗体共标，验证表达定位。
5. **人群遗传学分析**：分析UK Biobank中346,177名欧洲无关个体的全外显子测序数据，采用线性回归模型评估LEPR（rs1137101）与ADRB2（rs1042714）多态性的基因-基因相互作用对BMI的影响，并进行性别分层。

**研究结果**

**scRNA-seq揭示交感神经节中高表达瘦素受体的内皮细胞簇**
对普食和HFD喂养的雄性小鼠（各10只）的SCG和星状神经节进行scRNA-seq，经质控后获得73,042个单细胞，UMAP聚类识别出9个细胞簇。内皮细胞簇（marker: Cd31, Cav1, Vegfr2, Cdh5）中Lepr高度表达（71%内皮细胞表达Lepr，平均log₂(FC)=1.96），而其他细胞类型几乎不表达。通过免疫荧光在Lepr^Cre; LSL-YFP报告小鼠的SCG和皮下WAT（scWAT）及BAT交感神经束中，证实LEPR（YFP）与内皮标志物（CAV1, VEGFR2, CDH5）共定位，形成围绕酪氨酸羟化酶（TH）阳性交感神经元的薄层结构。

**LEPR⁺交感内皮细胞构成神经束膜屏障**
scRNA-seq显示该内皮细胞簇高表达神经束膜标志基因（Glut1, Itgb4, Lypd2, Mpzl2, Cldn1），其中Glut1被报道为泛神经束膜标志。共表达分析显示约20.2%的内皮细胞为Lepr⁺Glut1⁺。在Lepr^Cre; LSL-YFP小鼠中，GLUT1与YFP共存在于星状神经节、T11-L2交感神经节以及BAT和scWAT交感神经束的神经束膜中，证实SPCs即为该神经束膜内皮细胞。

**SPCs高度共表达Lepr和Adrb2，区别于其他细胞类型**
scRNA-seq发现内皮细胞簇中Adrb2高表达，而α-肾上腺素受体和β3受体表达极低。共表达分析显示20.4%内皮细胞为Lepr⁺Adrb2⁺，6%为Lepr⁺Glut1⁺Adrb2⁺。RNAscope在星状神经节、SCG和交感神经束中验证了Lepr和Adrb2 mRNA在GLUT1⁺或CAV1⁺SPC屏障中的共定位。相比之下，下丘脑弓状核仅0.01%神经元共表达Lepr和Adrb2，而交感神经节中SPCs的共表达水平达20.4%。分析Tabula Muris、小鼠细胞图谱及多个器官scRNA-seq数据集，发现除交感神经节外，其他组织（心、肝、胰、肌、脂肪等）中Lepr⁺Adrb2⁺双阳性细胞频率极低（通常<0.5%），与测序噪音无异。

**Lepr^Cre:Adrb2^fl/fl小鼠能量消耗和产热降低，肥胖风险增加，不依赖食物摄入**
在普食和HFD条件下，Lepr^Cre; Adrb2^fl/fl雄性小鼠体重显著高于对照（16周龄普食组P<0.001；HFD 12周P<0.001），而食物摄入无差异。体成分分析显示脂肪质量（尤以BAT和内脏脂肪）增加，瘦体质量无变化。间接量热法显示每日能量消耗降低（ANCOVA），VO₂和VCO₂呈下降趋势，呼吸交换比（RER）和活动无差异。BAT温度降低（普食P=0.019；HFD P=0.025），产热基因（Ucp1, Elovl3, Cidea, Prdm16）表达下调。排除Lepr^Cre本身干扰的对照实验确认表型源于Adrb2缺失。

**饮食诱导肥胖引起的高瘦素血症破坏SPC屏障**
scRNA-seq显示肥胖小鼠交感神经节中内皮细胞比例减少约20%（vs. 瘦小鼠）。免疫荧光定量显示HFD诱导的肥胖（DIO）小鼠scWAT和BAT交感神经束中LEPR⁺ SPC面积显著减少（scWAT P=0.003；BAT P=0.002），TH⁺交感轴突密度亦降低。电子显微镜证实肥胖小鼠scWAT神经束的神经束膜层数显著减少。Lepr^Cre; Adrb2^fl/fl小鼠亦呈现类似SPC减少和交感神经病变，且血浆瘦素水平升高（P=0.017），scWAT和BAT中去甲肾上腺素（NE）含量降低（普食和HFD均显著）。瘦素缺陷的ob/ob小鼠中SPC屏障和TH密度与野生型无差异，表明SPC丢失由高瘦素血症而非肥胖本身导致。

**肥胖和高瘦素驱动SPC凋亡，拟交感ADRB2激动作用可预防**
KEGG分析显示肥胖小鼠内皮细胞中凋亡通路富集，凋亡相关基因（如Tnfrsf1a）上调。免疫荧光证实DIO小鼠SCG和scWAT神经束中TNFR1在SPC屏障和交感神经元中高表达，TUNEL染色确认凋亡。体外SCG外植体实验：高瘦素（100 ng ml^?1）处理24 h导致CAV1⁺SPC屏障和TH⁺神经元显著减少，加入克伦特罗（β2激动剂）可完全逆转，而β1（多巴酚丁胺）或β3（米拉贝隆）激动剂无效；该保护作用被布托沙明（β2拮抗剂）消除。高剂量克伦特罗单独处理不影响SPC。体内用瘦素中和抗体（hLep Ab）处理DIO小鼠3周，体重下降（不依赖食物），scWAT和BAT中CAV1⁺SPC面积和TH密度显著恢复。口服克伦特罗5天同样可逆转SPC丢失和交感神经病变。

**人类SPCs共表达LEPR和ADRB2，常见多态性对男性肥胖风险呈协同作用**
对人类捐赠者（男、女）的交感神经节进行单核RNA测序，在内皮细胞簇中观察到LEPR与ADRB2共表达，并通过RNAscope在人星状神经节CAV1⁺神经束膜中验证。分析公开的scRNA-seq数据，人类scWAT（25,123细胞）仅0.02%和BAT（72,594细胞）仅0.002%双阳性。在UK Biobank欧洲人群中，单独LEPR rs1137101（Gln223Arg）或ADRB2 rs1042714（Gln27Glu）与BMI无显著关联，但二者存在显著协同效应（BMI>25组 beta=0.047, P=0.0056）；性别分层显示该效应仅在男性中显著（BMI>25组 beta=0.057, P=0.04）。AlphaFold2建模和分子动力学模拟未发现两种受体存在直接物理相互作用或显著影响配体结合稳定性。

**讨论与结论**
研究人员总结认为，Lepr⁺Adrb2⁺ SPCs是瘦素作用神经内分泌网络的外周组成部分，能够感知并整合传入瘦素和传出去甲肾上腺素能信号。SPCs通过维持神经束膜屏障完整性保护交感神经元，调节脂肪组织能量消耗。肥胖时慢性高瘦素血症驱动SPCs凋亡，破坏屏障，引发交感神经病变，降低脂肪产热，形成恶性循环。该机制为理解除中枢食欲调控外的瘦素抵抗外周层面提供了新模型。ADRB2激动剂或瘦素部分降低均可逆转这一病理过程。人类遗传学数据支持SPCs在男性肥胖易感性中的潜在作用。未来研究需开发交叉遗传工具以在体内同时调控Lepr和Adrb2共表达域，并探索通过双重靶向LEPR和ADRB2（如单分子多药疗法）绕过中枢瘦素抵抗的可能性。