链霉菌中氨基糖苷类生物合成的双重沉默用于新型抗菌药物的发现

《Microbial Biotechnology》：Dual Silencing of Aminoglycoside Biosynthesis for the Discovery of Novel Antimicrobials in Streptomyces

　　

链霉菌(Streptomyces)物种是抗菌物质的丰富来源，然而由于其常见抗生素的重复发现（例如链霉素约1%，链硫菌素约10%），其巨大的生物合成潜力仍未得到充分开发。为解决这一挑战，研究人员开发了一种双层生物合成阻断系统，命名为CI-ARS3，其整合了两个正交的沉默模块：一个竞争性转录沉默子，用于抑制天然生物合成基因簇(Biosynthetic Gene Cluster, BGC)的转录；以及一个基于反义RNA(Antisense RNA, asRNA)的沉默子，促进BGC衍生mRNA的降解和/或翻译抑制。该系统在编码两个模块的单一attB位点整合质粒(pSET152-aafssf)上实现，在54株链霉菌中强力抑制链霉素和链硫菌素的生物合成，在测试条件下对目标化合物实现超过97%的抑制效率且具有高度特异性。去除这些显性背景后，发现了enissomycin，一种此前未报道的抗菌分子。Enissomycin对鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)表现出强效活性（MIC 4–8 μg/mL），且未显示显著细胞毒性，突显其在药物开发中的前景。总之，CI-ARS3是一个用于链霉素和链硫菌素高效去重复化的稳健平台，从而加速从链霉菌中发现新型抗微生物化合物。

该研究发表于《Microbial Biotechnology》。目前链霉菌来源的抗菌药物挖掘面临高频重复发现已知氨基糖苷类抗生素（如链霉素约1%、链硫菌素约10%）的严重干扰，这些显性背景掩盖了新型活性代谢物的检测，且传统基因组编辑手段如CRISPR/Cas9存在操作繁琐、菌株兼容性差等问题。为此，研究人员开发了名为CI-ARS³（竞争性抑制-反义RNA协同沉默系统）的双层生物合成阻断平台，通过在单一质粒上整合竞争性转录沉默与反义RNA介导的mRNA降解双重机制，实现对链霉菌中链霉素和链硫菌素生物合成基因簇(BGC)的高效特异性抑制（效率超97%），成功在54株测试菌株中消除背景噪音并发现了新型抗菌分子enissomycin，其对鲍曼不动杆菌具有显著活性且无显著细胞毒性，为加速链霉菌未开发化学空间的挖掘提供了简便通用的工具。

研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：构建链霉菌分离株库（来源于中国多地土壤样本及商业来源的模式菌株如S. griseus DSM 40236与S. lavendulae NBRC 12789），设计基于结构截短的路径特异性调节蛋白（StrR299、StnR243）作为竞争性转录沉默子(CoBTSi)，设计靶向strL与stnQ基因保守区的反义RNA(asRNA)作为BGC沉默子(AsRBSi)，筛选并替换组成型启动子（P17）以维持长效沉默，通过单质粒pSET152-aafssf整合至基因组attB位点实现双模块耦合，利用比色法、LC-MS/MS定量氨基糖苷类产量，RT-qPCR分析转录水平，以及通过发酵提取物进行抗菌活性导向分离与NMR、X射线单晶衍射进行结构表征。

3 Results and Discussion

3.1 Screening of Streptomycin- and Streptothricin-Producing Streptomyces Strains

研究人员通过对385株实验室分离链霉菌进行比色法初筛及LC-MS/MS与PCR验证，确认17株产链霉素、38株产链硫菌素，其中Streptomyces sp. CPU214为共生产者，建立了用于后续沉默系统验证的菌株库。

3.2 Developing a Competitive BGC Transcriptional Silencer in Model Streptomyces

研究人员构建截短调控蛋白StrR299与StnR243作为竞争性BGC转录沉默子(CoBTSi)，在S. griseus与S. lavendulae中分别使链霉素与链硫菌素BGC关键基因转录水平降至野生型30%以下，代谢产物积累降至约25%与17%，证实竞争抑制有效但未完全消除产量。

3.3 Developing an Antisense RNA-Based BGC Silencer in Model Streptomyces

研究人员设计靶向strL与stnQ的40、60、80 bp反义RNA(asRNA)并引入末端茎环结构，发现40 bp aRstrL40与60 bp aRstnQ60分别具有最强沉默效果，但单独AsRBSi同样无法在中后期发酵完全阻断产物积累。

3.4 Selection of Promoters for CoBTSi and AsRBSi

研究人员发现原启动子kasOp在发酵后期活性衰减导致沉默效率下降，筛选组成型启动子P15、P17、P24后确认P17能维持高持续转录活性，替换后使链霉素与链硫菌素产量在发酵中后期降至野生型10%以下。

3.5 Establishment of a Dual-Layer Silencer by Coupling CoBTSi and AsRBSi

研究人员将CoBTSi（strR299、stnR243）与AsRBSi（aRstrL40、aRstnQ60）在P17驱动下组装为单顺式元件aafssf并整合至pSET152，构建CI-ARS³系统。在S. griseus与S. lavendulae中分别将链霉素与链硫菌素产量抑制至野生型的1.84%与2.29%，全周期维持低于2.6%，证明双层协同显著优于单层沉默。

3.6 Application of CI-ARS³in 54 Streptomyces Species

研究人员将CI-ARS³扩展至54株链霉菌（17株产链霉素、38株产链硫菌素、1株共产），所有菌株链霉素产量降至野生型2.3%以下（6株未检出），链硫菌素降至2.8%以下（12株未检出），共生产株CPU214亦实现近完全阻断，证明系统具有广谱兼容性与100%成功率，无需基因组先验信息。

3.7 Discovery of the Novel Compound Enissomycin

研究人员在消除氨基糖苷背景后对54株突变株发酵提取物进行抗菌活性评估，14株保留活性，12株出现新代谢物或原有低丰度代谢物上调。从中分离鉴定20个化合物，仅化合物20（m/z=209.0565 [M+H]⁺）为结构新颖分子，命名为enissomycin，由Streptomyces sp. CPU306-ci-ars³产生，野生型及空载对照未检出，CI-ARS³使新颖发现率提升至5%，高于传统筛选1.9%。

3.8 Antibacterial Efficacy of Enissomycin

研究人员测定enissomycin对临床病原菌的MIC，其对鲍曼不动杆菌（包括ATCC 19606、BAA-1605、17978及临床分离株）为4–8 μg/mL，对铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、MRSA及白色念珠菌活性较弱（MIC≥64 μg/mL）。细胞毒性实验显示对HEK293与HepG2的IC₅₀分别为647.14 μM与592.93 μM，治疗窗口宽，安全性良好。

总结讨论部分

研究人员指出CI-ARS³相较于CRISPRi不受PAM限制与宿主耐受低的影响，具备更优的链霉菌兼容性、单质粒一步阻断、无需基因组数据与异源大效应蛋白表达等优势。沉默BGC可能通过节约葡萄糖衍生前体重定向代谢流至其他次级代谢途径，改变宿主代谢谱，不同于异源表达激活策略。Enissomycin含苯并恶唑核心，可能与chorismate来源途径相关，具开发潜力。未来可拓展至四环素、放线菌素D等其他已知抗生素的去重复工具。

结论部分翻译

综上所述，为减轻两种普遍存在的氨基糖苷类——链霉素和链硫菌素的干扰，本研究首创了一种称为CI-ARS³的双层生物合成阻断系统，其整合了BGC转录抑制与mRNA降解机制。这一多功能沉默工具包通过单一质粒pSET152-aafssf递送，包含非功能性路径特异性调节蛋白(PSR)基因与反义RNA表达盒的串联插入。CI-ARS³能在原生链霉菌中强力抑制抗生素生物合成，无需进一步遗传操作。因此，它在抗菌筛选中显著最小化背景干扰，同时对细胞生长无明显影响。应用于54株产链霉素和/或产链硫菌素菌株时，CI-ARS³不仅强力抑制这些高频重复发现抗生素的产生，还可能通过改变葡萄糖代谢流潜在改变了原生次级代谢轮廓。该氨基糖苷消除策略由此促进了enissomycin的发现，这是一种对鲍曼不动杆菌及其耐药株具有强效作用且无显著细胞毒性的新型抗菌分子。因此，enissomycin成为针对WHO优先级病原体临床开发的候选分子。总体而言，CI-ARS³是一个简化且适应性强的已知抗生素去除工具，从而促进链霉菌资源的深度开发。

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