进化保守的跨膜区TM3/TM4疏水性及空间位阻平衡调控Orai1孔道开放

《Protein Science》：Evolutionarily conserved hydrophobicity and sterics in TM3/TM4 balance Orai1 pore opening

　　

钙(Ca2+)通道Orai1作为Ca2+释放激活的Ca2+通道(CRAC)的孔道形成亚基，在其生理激活剂——内质网(ER)驻留Ca2+感受器基质相互作用分子1(STIM1)感知ER Ca2+库耗竭后被打开。STIM1主要与Orai1 C末端结合，将激活信号从通道外周经所有跨膜(TM)域传递至传导Ca2+的孔道。研究人员此前证实STIM1偶联引发Orai1 TM3/TM4界面构象变化从而诱导孔道开放。本研究揭示V181(TM3)、F250与F253(TM4)周围的立体排斥与疏水相互作用的精细平衡是维持正常生理功能所必需的。研究人员表明该区域的侧链体积与疏水性共同决定了通道复合物在关闭状态的稳定性以及Ca2+内流的幅度。在生理设定下，V181周围的这种精细调节允许充分的激活，同时防止过大的Ca2+电流。

该研究围绕Ca²⁺释放激活的Ca²⁺通道(CRAC)的核心组分Orai1展开。细胞内Ca²⁺稳态失衡关联多种疾病，而Orai1孔道开放受STIM1调控的信号转导机制中，周边跨膜(TM)域尤其是TM3与TM4界面的物理化学特性如何精确调控门控尚不清楚。既往研究提示TM3位点V181的取代显著影响功能，且TM3/TM4界面的润湿状态与关闭态维持相关，但疏水性与空间位阻在该界面的联合作用机制不明。研究人员通过开展位点定向诱变、非天然氨基酸(UAA)插入、电生理记录、Ca²⁺成像、FRET显微镜、NFAT核转位分析及全原子分子动力学(MD)模拟，系统探究了TM3/TM4界面V181、I182、A254(TM3)与F250、F253(TM4)等保守残基的侧链体积与疏水性如何平衡Orai1的关闭态稳定与STIM1诱导的孔道开放，旨在阐明生理状态下防止Ca²⁺过载的分子微调机制，论文发表于《Protein Science》。

研究人员使用的主要关键技术方法包括：基于人胚肾293(HEK293)细胞及CRISPR-Cas9 STIM1/STIM2双敲除(DKO) HEK293细胞模型的表达与功能检测；遗传密码扩展(GCE)技术整合光敏非天然氨基酸(Azi、Bpa)；全细胞膜片钳电生理记录CRAC电流；R-GECO1.2荧光Ca²⁺成像；共聚焦FRET评估STIM1-Orai1耦合；共聚焦显微镜定量NFAT核转位；基于Orai1同源模型的全原子MD模拟分析残基接触频率；基于Eisenberg等标度的疏水性定量分析。

2 RESULTS

2.1 Large aromatic side chains in TM3 or TM4 lead to STIM1 independent constitutive activation

研究人员通过在TM3的V181、I182及TM4的A254引入大体积芳香族氨基酸取代发现，相比野生型，V181Y/W、I182Y、A254L/F/W等在无STIM1时即表现出显著的组成型活性Ca²⁺内流与内向整流电流，反转电位约+50 mV，且伴随NFAT核转位增强；表明在TM3/TM4界面引入大侧链芳香族残基可通过空间位阻效应驱动孔道开放，此时侧链大小而非疏水性主导关闭态破坏。

2.2 Double substitutions combining different hydrophobic substitutions in TM3 and TM4 can elevate constitutive activity

研究人员构建TM3与TM4对侧位点的双重取代如V181F A254L/W、V181W A254Y/W、I182Y A254F等，发现多数组合在无STIM1下进一步增强组成型电流，且在STIM1存在下不再显著升高，部分组合FRET显示与STIM1结合略有改变；NFAT转位与电生理结果一致；说明跨TM3/TM4界面的协同立体效应可完全绕过STIM1产生强组成型激活，某些大活性双突变可能影响STIM1耦合效率。

2.3 Orai1 V181F is retained in the closed state due to an inhibitory role of the V181F-F250 contact

单突变V181F及V181Azi在有无STIM1下均几乎无活性，FRET证明仍可与STIM1结合；在V181F背景下对TM4的F250或F253进行取代发现，F250A/S/C/V能恢复STIM1介导的电流，而F250W不能；相反F253W可恢复，F253A/S则不能；UV照射V181Azi组合突变可进一步激活电流；MD模拟显示野生型V181主要与TM4接触，V181F使F181接触向TM2'偏移并增强与F250的TM3-TM4接触，F250偏好TM3、F253偏好TM2与膜；表明V181F通过与F250形成抑制性立体接触锁住关闭态，削弱该接触或调整F253立体环境可解除抑制。

2.4 Hydrophobic core along the TM3/TM4 interface maintains the closed state

在V181F/Azi背景下将F250与F253同步取代为不同疏水性残基(S<C<A<W<I)，电生理显示STIM1诱导电流密度随F250/F253疏水性升高而逐步下降，与Eisenberg疏水性标度呈近完美皮尔逊相关(V181F:0.99；V181Azi:0.96)，而范德华体积相关性弱；F250I F253I完全抑制激活，F250S F253S则超过野生型电流；UV激活下Azi突变体电流增强与侧链大小相关而非疏水性；Bpa突变体则显示立体体积主导调控；说明TM3/TM4界面疏水核心维持关闭态并微调最大激活水平，过度疏水阻碍开放，降低疏水则增强可激活性。

2.5 Decreased hydrophobicity in the TM3/TM4 interface in the plane of V181 leads to STIM1 independent Orai1 activation

在非V181F背景下降低TM3/TM4平面疏水性如V181S F250S F253S、L185S F250S、L185A F250A均产生弱组成型活性与NFAT转位，STIM1存在下V181S F250S F253S电流超过野生型，而V181I F250I F253I完全无电流；ConSurf-DB保守性分析显示F250、F253、F257最高保守，V181次之，L185第三；表明TM3/TM4界面疏水残基进化上保守，其疏水性降低破坏关闭态稳定性导致组成型激活，并在STIM1刺激下过度开放，生理疏水水平在足够激活与防过载间平衡。

3 DISCUSSION

讨论部分指出，研究人员通过位点定向诱变聚焦于V181及其环境，强调TM3/TM4界面立体限制与疏水效应对平衡Orai1生理功能的临界作用；Orai1孔道开放可由V181周围侧链体积增大引发，契合STIM1耦合诱导的TM3/TM4界面扩张；除构象重排外，周边TM3/TM4域界面疏水效应微调Ca²⁺内流量；天然氨基酸属性在侧链大小与疏水性上被优化以使Orai1可被STIM1可靠激活同时防过度激活与胞内Ca²⁺超载；芳香族侧链在V181、I182、A254可诱导弱组成型活性，双重取代进一步增强，提示大小效应优于疏水性；V181F失活源于与F250抑制性立体相互作用，MD显示F181接触向TM2'偏移并增强TM3-TM4接触，解除F250或调整F253可恢复；TM3/TM4界面延伸疏水核心(F250-253)维持去水化关闭态，疏水性降低增强STIM1可激活性甚至超过野生型，过高疏水则完全阻断；定量上F250/F253变异电流与Eisenberg疏水性标度近完美相关，可能反映激活中化学环境趋极性；UV效应源于光交联立体约束而非瞬时疏水性变化；综上，TM3/TM4界面物理化学特性微妙平衡——立体扩张促开放，疏水作用稳关闭并防过激活——是Orai1门控核心，STIM1信号传播构象机制仍需进一步阐明。

研究结论部分翻译：研究人员对V181及其环境的位点定向诱变分析强调了基于TM3/TM4界面沿线的立体限制与疏水效应在平衡生理Orai1功能中的关键作用。Orai1孔道开放可通过V181周围侧链体积增大实现，该机制可能由STIM1结合诱导的TM3/TM4界面扩张所促成，与我们此前的发现相契合。除介导Orai1激活的这种构象重排外，Ca²⁺内流幅度受到周边TM3/TM4域界面沿线的疏水效应微调。总体而言，我们的数据表明，氨基酸特性——最重要的是侧链大小与疏水性——在自然界中被精确优化，使得Orai1通道能够被STIM1可靠且充分地激活，同时防止过度激活与胞内Ca²⁺超载。