呼吸链复合物I中组氨酸开关动力学的分子与能量基础

《Protein Science》：Molecular and energetic basis of histidine switch dynamics in respiratory complex I

　　

线粒体和细菌中的呼吸链复合物I（respiratory complex I）驱动醌（quinone）的两电子还原以跨膜泵送质子。尽管该复合物的结构表征取得了显著进展，但该催化反应的分子基础仍然是个谜。其膜结构域远端反向转运蛋白样亚基中一个高度保守的组氨酸残基（histidine residue）在分子模拟和冷冻电镜结构中显示出构象变化。然而，组氨酸开关动力学（histidine switch dynamics）的功能及其构象转变的能量学仍不清楚。在此，通过应用增强采样经典分子动力学模拟（enhanced sampling classical molecular dynamics simulations），研究人员评估了组氨酸开关动力学的能量学，并证明它与组氨酸的互变异构状态（tautomeric state）以及相距约10?的赖氨酸残基（lysine residues）的电荷状态耦合，这些因素导致氢键重组并将组氨酸残基稳定在特定构象中。基于混合QM/MM元动力学（hybrid QM/MM metadynamics）的自由能模拟表明，组氨酸开关参与门控质子转移（gated proton transfer），并可能在复合物I及相关蛋白中作为质子共轭装置（proton confurcation device）发挥作用。

**研究背景与问题**
呼吸链复合物I（respiratory complex I, RCI）是线粒体和细菌中最大的呼吸链复合物，负责将NADH氧化与醌还原耦合，并跨膜泵送质子以生成ATP合成所需的质子梯度。尽管高分辨率冷冻电镜结构已解析了RCI的整体架构，但质子泵送的具体分子机制，尤其是醌还原反应如何远程触发质子转移，仍不明确。其膜结构域中三个反向转运蛋白样亚基（NuoL、NuoM、NuoN）被认为是质子泵送的关键，其中NuoL亚基含有一个高度保守的组氨酸残基（His254），该残基在分子模拟和冷冻电镜中表现出构象变化，可在两种构象（A和B）之间切换，但该组氨酸开关（histidine switch）的功能及其构象转变的能量学基础尚不清楚。为此，研究人员通过多尺度模拟定量评估了His254在不同质子化状态下的动力学与能量学，旨在揭示其在质子泵送中的角色。

**研究内容与结论**
研究人员采用增强采样经典分子动力学模拟（accelerated weight histogram, AWH）和混合量子力学/分子力学（quantum mechanics/molecular mechanics, QM/MM）元动力学自由能模拟，系统分析了大肠杆菌RCI中NuoL亚基的组氨酸开关动力学。结果表明，His254的构象偏好受其自身互变异构状态（δ-或ε-氮质子化）以及周围三个严格保守的赖氨酸残基（Lys342、Lys305、Lys229）的质子化状态调控。通过氢键网络重组，这些残基的电荷变化可稳定或改变His254的构象，从而切换质子转移路径。HM/MM模拟进一步证实，组氨酸开关可作为门控质子转移元件：在A构象下，它参与从细胞质侧向亚基内部的质子摄取；在B构象下，它连接中心亲水轴与质子释放路径。该研究提出，组氨酸开关是一种高效的质子共轭装置（proton confurcation device），可协调多个质子转移路线，实现质子泵送的方向性。论文发表在《Protein Science》。

**主要技术方法**
研究基于大肠杆菌RCI的2.4?冷冻电镜结构（PDB 7P7C）构建模型，包含五个膜结合核心亚基（NuoL、NuoM、NuoN、NuoK、NuoJ），嵌入由75% POPE、20% POPG和5%心磷脂组成的脂质双层，溶剂化后体系约30万个原子。采用CHARMM36力场，通过AWH增强采样方法模拟组氨酸开关在不同质子化状态下的自由能景观，并利用混合QM/MM元动力学（DFT级别B3LYP/def2-SVP）计算质子转移的势能剖面。总模拟采样时间约59微秒（39微秒无偏模拟加20微秒AWH模拟），QM/MM模拟约30皮秒。

**研究结果**
**2.1 组氨酸开关的动力学与能量学（增强采样模拟）**
通过AWH模拟，以His254与Thr312和Ser150的距离差为反应坐标，计算了不同赖氨酸质子化状态下的势能均值（PMF）。发现构象A（指向Lys342）在多数状态中能量更低，与冷冻电镜中大肠杆菌RCI的观察一致。但赖氨酸质子化状态改变可显著影响平衡：例如，Lys305或Lys229质子化使构象B能量升高2–3 kcal/mol；当所有三个赖氨酸均质子化时，两个构象能量差降至2–3 kcal/mol。分析表明，构象A周围存在疏水屏障，而赖氨酸质子化诱导的水化作用可破坏该屏障，稳定构象B。

**2.2 不同互变异构状态下组氨酸开关的能量学与动力学**
组氨酸的互变异构状态（δ-或ε-氮质子化）对His254动力学有强影响。在δ-质子化状态下，His254在B构象中与Ser150形成稳定氢键，并通过水分子与质子化的Lys229连接；而ε-质子化状态下，Ser150无法作为氢键受体，导致B构象不稳定。例如，在三个赖氨酸均质子化状态（+++）下，δ-质子化使B构象稳定，而ε-质子化则使B构象能量升高约5 kcal/mol。此外，双质子化（咪唑鎓）组氨酸会从A构象位移至中间位置，因无法与Thr312形成氢键并与质子化的Lys342产生静电排斥。

**2.3 质子转移的QM/MM自由能模拟**
基于AWH模拟快照，设置QM/MM元动力学模拟探测质子转移。在A构象下，质子可从细胞质侧的Lys305经His254桥接网络转移至埋藏的Lys342，三个独立模拟中有两个展示了热力学有利的质子转移，能量最低点出现在反应坐标约4?处，对应质子从Lys305迁移至Lys342。这表明该过程可能对应醌还原反应后向NuoL亚基装载泵送质子的步骤。在B构象下，质子从Lys229向His254转移在模拟中能量不利（产物态不稳定约4 kcal/mol），但进一步采样表明，额外构象变化可降低能垒，暗示组氨酸开关在B构象中可能作为质子门控装置，防止质子反向泄漏。

**总结讨论与结论**
讨论部分指出，组氨酸开关通过切换A/B构象，可选择性连接或断开不同质子转移路径：在A构象下，His254连接细胞质侧质子摄取路线与释放路线，同时阻断中心亲水轴；在B构象下，则连接亲水轴与质子释放路线，并脱开摄取路线。这种机制使RCI能够将来自N侧和中心亲水轴的质子汇聚至P侧释放路径，起到质子共轭装置的作用。该组氨酸在进化上高度保守，在光合复合物I和能量转换氢化酶中也有发现，但在膜结合氢化酶等酶中不保守，可能由其他位置的组氨酸功能补偿。研究结论：多尺度模拟数据强烈表明，His254是一种分子开关，能够开启和关闭质子转移路径，并在呼吸链复合物I及进化相关蛋白中作为高效的质子共轭装置发挥作用。