钠离子影响GPR17构象状态与功能

《Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics》：Sodium Ions Affect GPR17 Conformational States and Functionality

　　

钠离子是多种A类G蛋白偶联受体（class-A GPCR）的变构调节剂，调节活性与非活性构象状态，并可能成为优化结晶程序的关键问题。在此，研究人员通过分子动力学模拟（MD）研究了野生型GPR17以及在两个与钠离子相互作用相关的不同残基（D77A和D293N）上发生突变的GPR17在非活性和活性构象中的Na⁺对GPR17构象状态调节的作用。研究人员观察到，Na⁺稳定非活性野生型构象的程度大于活性构象，因为在活性构象中，Na⁺与D77/D293之间对受体稳定至关重要的相互作用被破坏。除建模研究外，研究人员还利用携带钠结合残基D77和D293突变的受体变体，在体外研究了钠离子对GPR17结合特性和功能反应的作用。放射性配体结合研究使用GPR17选择性配体，未显示突变变体与野生型受体相比在GPR17结合特性上有任何显著改变。相反，对于Asinex1和LTD4，在D77、D293和D77/D293受体变体中，研究人员注意到与野生型形式相比，受体与G蛋白的偶联显著增加。最后，所有受体配体在D77、D293和D77-D293 GPR17中抑制cAMP累积的效力相比野生型受体形式均显著增加。总体而言，这些数据与建模研究一致，表明离子钠稳定了受体的非活性构象。当钠结合位点的残基发生突变时，离子无法再结合，从而有利于GPR17的活性构象。这些突变变体稳定了活性受体状态，可能最适合于均质受体纯化和结晶。

**钠离子调控GPR17构象状态与功能的机制研究——论文解读**

GPR17是一种A类G蛋白偶联受体（class-A GPCR），在心脏、肾脏和脑等缺血易损器官中高表达，被认为是神经退行性疾病（特别是多发性硬化症）的重要治疗靶点。先前研究已揭示GPR17具有双重药理学特性，可响应胞外尿嘧啶核苷酸和半胱氨酰白三烯，并参与损伤信号转导。近期冷冻电镜结构解析了GPR17与Gi蛋白结合的活性无配体状态，揭示了胞外环2（ECL2）插入正构口袋的拴系激动剂机制，以及以D77为中心的保守钠离子空腔。然而，钠离子如何通过该空腔调控GPR17的构象平衡和功能活性尚未明确。在多种A类GPCR中，钠离子作为负变构调节剂稳定非活性构象，但GPR17在7.49位点含稀有酸性残基D293，可能赋予其独特的钠敏感性。因此，研究人员系统开展了钠离子对GPR17构象状态和信号输出影响的分子机制研究，以期为受体优化和结晶提供理论基础。该论文发表在《Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics》。

研究人员主要采用以下关键技术方法：利用同源建模和分子对接生成GPR17的三种构象（自激活apo、非活性apo、与激动剂galinex结合的活性holo），并对野生型及三种突变体（D77A、D293N、双突变D77A/D293N）进行分子动力学模拟（MD，500 ns）以评估系统稳定性。通过三维参考相互作用位点模型（3D-RISM）计算钠离子密度图。在体外实验中，使用人星形细胞瘤1321 N1细胞分别转染野生型或突变受体，开展[³H]27-羟基胆固醇放射性配体结合实验、[³⁵S]GTP^γS结合实验（评估G蛋白激活）和cAMP累积实验（检测信号抑制）。此外，设计用于昆虫细胞（ExpiSF9）表达的BRIL融合GPR17变体（含D293N突变），进行表达和纯化。

**研究结果**

**3.1 同源建模**：通过同源建模生成了GPR17非活性和活性构象的三维结构，ECL2采用“开放”构象，拉氏图验证模型质量良好，仅少数高柔性区域残基偏离。

**3.2 分子对接**：对接模拟显示激动剂galinex与GPR17正构结合口袋（关键残基V83、R87、F111）相互作用，该位点远离由D77和D293构成的钠结合位点。

**3.3 MD模拟**：对12个系统（3种构象×4种基因型）进行500 ns MD模拟，RMSD显示所有系统约200 ns后达到平衡。在突变体（特别是D293N）中，galinex与受体形成更持久的氢键（如与ECL2的C157氧原子形成氢键，持续约80%模拟时间），稳定性增加。

**3.4 溶剂分析（3D-RISM）**：3D-RISM分析显示野生型GPR17螺旋核心存在钠离子结合位点，密度图靠近D77和D293。非活性构象中密度图更高，表明钠离子优先与非活性构象结合。突变体（D77A、D293N、双突变）导致密度图缩小，其中D293N突变对钠结合位点破坏更显著，影响TM2和TM7两侧的相互作用。

**3.5 含钠离子的MD模拟**：手动放置钠离子后进行250 ns MD模拟，发现钠离子存在时，TM6螺旋的RMSF降低，表明钠离子稳定了非活性构象，限制TM6灵活性。

**3.6 [³H]27-羟基胆固醇结合实验**：放射性配体结合实验显示，Asinex1和Cangrelor在野生型和突变受体中的结合亲和力（Ki）无显著差异，表明钠结合位点突变不影响配体结合。

**3.7 [³⁵S]GTP^γS结合实验**：在150 mM钠存在下，与野生型相比，突变体（D77A、D293N、双突变）对Asinex1和LTD4的EC50显著降低（p<0.05或p<0.01），表明G蛋白偶联增强。UDP-glucose仅在D293N突变体中EC50显著降低。

**3.8 cAMP累积实验**：所有配体（Asinex1、UDP-glucose、LTD4）在突变体中的EC50均显著低于野生型（p<0.05），表明突变增强了配体抑制cAMP产生的效力，即加速了受体向活性构象的转变。

**3.9 用于生化和结构研究的优化GPR17变体**：设计了含D293N突变、BRIL取代第三胞内环（ICL3）、N端StrepTag和C端His标签的GPR17-BRIL 16-339构建体，在昆虫细胞中成功表达和纯化，经亲和层析和金属螯合层析获得高纯度蛋白，为后续结构研究奠定基础。

**讨论与结论**
讨论部分指出，钠离子通过D77和D293稳定GPR17非活性构象，D293N突变对钠结合位点破坏更显著，因为GPR17在7.49位点具有罕见的酸性残基，增强了钠敏感性。突变导致受体偏向活性构象，因此在G蛋白偶联和cAMP实验中观察到效力增加。尽管配体结合未受影响，但功能效应增强支持钠离子作为负变构调节剂的角色。此外，D293N突变体可能更适合于均质受体纯化和结晶，研究人员据此设计了BRIL融合构建体并成功表达。需要指出的是，ICL3被BRIL取代后，该受体无法完全模拟天然G蛋白偶联，但适用于钠依赖性配体结合和构象稳定性分析。

研究结论翻译如下：
“本研究支持一个模型，其中钠离子通过保守的以D77 (2.50)和异常酸性残基D293 (7.49)为中心的钠口袋稳定非活性样受体群体，作为GPR17的负变构调节剂。计算溶剂映射和MD模拟表明钠离子优先占据非活性构象，并在离子存在下降低TM6的移动性，与经典的A类GPCR机制一致。破坏该口袋的突变不会显著改变配体结合亲和力，但会增加G蛋白偶联和cAMP实验中激动剂的效力，与非活性构象稳定性降低和向可激活状态更容易过渡相符。在无钠条件下直接实验探测显示，去除钠离子消除了可检测到的激动剂驱动的G蛋白激活，支持钠离子在偶联中的功能相关性。总之，这些结果表明，工程化钠口袋变体可以将GPR17的构象景观偏向信号能力状态，为旨在生化稳定和结构研究的构建体设计提供了依据。未来的工作应解决更长时间尺度上的缓慢构象转变，并将功能分析扩展到其他通路（如β-arrestin招募/内化）和受体-受体串扰背景。”