《Yeast》：Transposons as Tools for Future Genome Engineering in Yeasts and Filamentous Fungi
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转座子是塑造真核生物基因组结构的基础遗传元件。酵母与丝状真菌已成为合成生物学及代谢工程中生产生物基原料的重要底盘生物。本综述系统梳理了基于转座子的工具在上述真菌系统中用于基因组工程的研究进展与未来机遇。真菌 inverted terminal repeat（I
转座子是塑造真核生物基因组结构的基础遗传元件。酵母与丝状真菌已成为合成生物学及代谢工程中生产生物基原料的重要底盘生物。本综述系统梳理了基于转座子的工具在上述真菌系统中用于基因组工程的研究进展与未来机遇。真菌 inverted terminal repeat（ITR，反向末端重复）DNA转座子，以及 long terminal repeat（LTR，长末端重复）与非LTR逆转录转座子，可加速基因组突变，助力优良基因型与表型的筛选。CRISPR-associated transposons（CASTs，CRISPR关联转座子）在非酿酒酵母宿主中具有实现大片段转基因位点特异性整合的巨大潜力，可突破同源重组（HR）效率低下的限制。总体而言，基于转座子的工具是加速酵母与丝状真菌基因组工程及菌株开发的极具价值且尚未充分挖掘的途径。
1 引言
转座子又称转座元件，是真核生物基因组的重要组成部分，最早由Barbara McClintock在玉米籽粒花斑色泽研究中证实其功能。在生物工程领域，转座子及其衍生系统已被广泛应用于基因挖掘与二代测序文库构建，并在细菌、哺乳动物细胞及植物的合成生物学基因组工程中发挥作用。酵母与丝状真菌作为重要的工业微生物，被广泛用于合成生物学改造以提升多种生物产品的产量与生产效率，但转座子作为该类真菌基因组工程工具的潜力仍未得到充分开发。转座子主要分为I类逆转录转座子与II类DNA转座子两大类：I类逆转录转座子包含LTR逆转录转座子（如酿酒酵母中的Ty1元件）与非LTR逆转录转座子（如人类基因组中高丰度的LINE-1元件），通过“复制-粘贴”机制转座，可分为自主型与非自主型；II类DNA转座子中，亚类1的ITR DNA转座子通过非复制型“剪切-粘贴”机制移动，代表性系统包括Tc1/Mariner、piggyBac与Sleeping Beauty，部分细菌ITR转座子如Tn3、Tn7则采用共整合体解析的复制策略；亚类2的复制型DNA转座子包括无ITR但含保守末端基序的Helitrons，以及含长ITR的Mavericks（Polintons）。不同转座子在作用机制、宿主范围、插入偏好与转座效率上存在显著差异，明确这些特征对设计高效转座子工具以推进酵母与丝状真菌的基因组工程及生物生产优化至关重要。转座子衍生工具已在多物种基因组研究中广泛应用，尤其适用于随机基因组诱变以定位功能基因及筛选标记切除，相较于传统诱导诱变与理性菌株文库构建，转座子辅助诱变可低成本生成大规模突变体库，并通过测序快速解析表型变异的遗传基础，对提升生物生产的真菌工程具有重要价值。此外，CRISPR关联转座酶（CAST）系统可实现超过10 kb的大片段DNA cargo的位点特异性整合，且不依赖宿主同源重组（HR）修复通路，这一特性对HR效率普遍较低的酵母与丝状真菌基因组工程极具吸引力。本综述系统梳理了多种转座子系统的特征，探讨其在酵母与丝状真菌基因组工程中的应用前景，首先聚焦ITR DNA转座子与逆转录转座子在真菌系统中的研究进展，随后总结CRISPR关联转座子（CAST）在哺乳动物与植物细胞基因组工程中的发展现状，最后展望这类系统在高通量真菌宿主代谢工程中的应用潜力。
2 ITR DNA转座子
ITR DNA转座子包含三个核心模块：ITR、转座酶与靶标重复序列（TDS），不同转座酶的ITR与TDS识别特异性决定了插入偏好。该类转座子在酵母工程中应用广泛，而在丝状真菌中的研究多集中于基础表征。
2.1 典型细菌DNA转座子在酵母基因组诱变文库构建中的探索
细菌转座子（Tn元件）中，Tn3、Tn5与Tn7较早被用于构建酵母基因组插入文库。Tn3衍生的穿梭诱变可从大肠杆菌中构建克隆酵母DNA片段的插入文库，实现蛋白标签的框内融合表达，全基因组规模的Tn3插入文库筛选已鉴定出300余个此前未注释的开放阅读框，但全基因组文库构建与随机插入流程工作量较大。Tn5系统（尤其是商业化EZ-Tn5转posome）通过体外组装高活性Tn5转座酶与含19 bp mosaic end（ME）序列的供体DNA形成稳定转座体，电转化后可实现异源基因在大肠杆菌基因组的随机整合，该转座体在酿酒酵母中也已实现转座事件。Tn7因插入偏好性低于Tn5与Mu，可作为基因组规模文库构建的补充系统，其插入文库已用于植物病原丝状真菌的基因功能鉴定，但需注意Tn7的左右末端在真菌中可作为转录终止子导致提前多聚腺苷酸化。细菌转座子在真核系统中的整合活性普遍较低，可能与转座酶的过表达抑制（OPI）机制有关；经工程改造的单链二聚体高活性Tn5转座酶融合核定位序列后，在HeLa细胞中的活性较单体版本提升约7倍，该变体有望在真菌系统中实现功能性体内转座。
2.2 真核转座子在酵母基因组诱变与工程中的应用
hAT家族的Ac/Ds系统（源自玉米）、Hermes（源自家蝇）及昆虫来源的piggyBac等ITR DNA转座子已在酿酒酵母、白色念珠菌与粟酒裂殖酵母中成功重构并验证体内活性。其中Ac/Ds系统被用于酵母饱和转座子分析（SATAY），可便捷构建全基因组诱变文库。hAT家族转座子产生8 bp靶标位点重复（TSD），整体靶标序列偏好较弱，仅Hermes偏好nTnnnnAn序列；该类转座子需要较长的亚末端重复序列以促进转座体组装，不利于插入后形成无缝框内蛋白标签融合，而Tag1元件的末端仅需100 bp，但尚未在异源真菌系统中验证活性。Tc1/mariner家族转座子（如Sleeping Beauty）在酵母中重构成功，偏好TA二核苷酸靶标位点，ITR序列短且近乎完美；水稻来源的Stowaway微型反向重复转座元件（MITEs）与其对应的Osmar14转座酶在酿酒酵母中表现出优异的转座活性，经ITR序列优化后可进一步提升效率，是酵母基因组工程的潜在优质工具。
2.3 DNA转座子在丝状真菌中的研究进展
Tc1/mariner与hAT家族的DNA转座子（如Fot1、Pot2、impala、Flipper、Restless）已在真菌中被鉴定。多数丝状真菌转座子研究聚焦于其对基因组进化与致病性的作用，工程化改造多在病原宿主中开展，如稻瘟病菌Magnaporthe oryzae、植物病原真菌禾谷镰刀菌Fusarium graminearum及人类病原真菌烟曲霉Aspergillus fumigatus等。在生物技术重要宿主中，黑曲霉Aspergus niger、产黄青霉Penicillium chrysogenum与粗糙脉孢菌Neurospora crassa中均已鉴定到DNA转座子，其中重复转座子序列而非单拷贝转座子会被甲基化，提示宿主甲基化可能影响异源转座子功能；Restless转座子虽表现出切除活性但未留下典型转座足迹，后续研究证实Tan1/Vader可在黑曲霉中实现有效转座。近期研究利用Minos与Restless驱动的转座子诱变筛选嗜冷真菌Geomyces sp. WNF-15A的红色色素高产菌株，超过10%的插入突变体表现出色素产量提升或生长增强，最优菌株产量较野生型提高约130%，证实了转座子诱变在微生物高产菌株筛选中的有效性。此外，丝状真菌中广泛存在的Starship巨型转座子大小可达15 kb至近700 kb，利用酪氨酸重组酶（“Captain”蛋白）转座，偏好TTAC四核苷酸整合位点，可携带多样cargo基因并介导跨物种水平基因转移，其遗传模块的工程化应用仍有待挖掘。
3 逆转录转座子
逆转录转座子存在于原核与真核生物基因组中，真核生物中包括LTR逆转录转座子（如酵母Ty元件）与非LTR逆转录转座子（如LINE-like元件），原核生物中主要为以RNA为中间体、经逆转录转座的group II内含子。逆转录转座子通过“复制-粘贴”机制在基因组中产生多个新拷贝，酿酒酵母基因组中Ty元件占比约3%，且丰度在不同地理来源的菌株中存在显著差异。目前真菌合成生物学中主要对LTR逆转录转座子进行工程化改造，非-LTR逆转录转座子与group II内含子尚未得到充分开发。
逆转录转座子的活性可通过反向内含子实验验证：将反向插入的选择标记基因（如his3AI、kan/neoAI）整合到逆转录转座子的转录单元中，内含子会在RNA加工过程中被剪接去除，剪接后的转录本经逆转录后通过转座整合到基因组新位点。LTR逆转录转座子的双链cDNA经整合酶介导整合到基因组，机制与ITR DNA转座子类似；非-LTR逆转录转座子则通过靶标引导逆转录（TPRT）机制，以内切酶切割靶DNA暴露的3'-OH为引物，直接在整合位点启动逆转录转座子RNA的逆转录，形成 flanked by TSD的新拷贝。
酵母中LTR逆转录转座子普遍存在中度至强整合位点偏好：酿酒酵母中Ty1、Ty2、Ty3、Ty4偏好RNA聚合酶III转录区，Ty5偏好异染色质与沉默染色质域；粟酒裂殖酵母的Tf1与Tf2偏好RNA聚合酶II转录基因的启动子区，且几乎不整合到着丝粒与近着丝粒异染色质。多数LTR逆转录转座子的整合偏好受靶标序列与染色质结构调控，目前仍有大量LTR逆转录转座子未被表征，包括多形汉逊酵母Ogataea polymorpha的Tpa5、白色念珠菌Candida albicans的Tca5、解脂耶氏酵母Yarrowia lipolytica的Ylt1及厌氧肠道真菌中的相关元件。丝状真菌中LTR逆转录转座子分布广泛，如稻瘟病菌中的MAGGY已在异源宿主Colletotrichum lagenarium与P. zingiberi中验证活性，但在黑曲霉、产黄青霉、米曲霉A. oryzae等重要工业宿主中的功能研究仍较少。
非-LTR逆转录转座子中的LINE-like元件已在酵母中完成工程化，如白色念珠菌的Zorro3在本源宿主与酿酒酵母异源宿主中均表现出活跃逆转录转座活性，偏好靶向poly(A)序列。逆转录转座子插入可导致基因 disruption，引发特定表型，如α-信息素抗性；通过改造Ty整合酶的靶标识别域可显著降低天然插入偏好，如Ty5 M3突变体破坏了整合酶的Sir4结合域，使约50%的整合事件发生在编码基因区。Ty元件整合到无启动子基因的上游时可激活其转录，这一特性是常规ITR DNA转座子不具备的，可用于筛选酵母细胞工厂中提升生物产量的优良上调基因型。
4 CRISPR关联转座子（CASTs）
CAST天然存在于原核生物中，目前已用于真核生物基因组的大片段外源DNA靶向整合，该过程不依赖DNA双链断裂（DSB）与HR，对HR效率低的宿主具有显著优势。目前CAST工具已在哺乳动物与植物细胞中成功适配，在酵母与丝状真菌基因组工程中极具应用潜力。
I-F型与V-K型CAST是研究最为深入的系统，已在哺乳动物细胞中完成工程化改造：I-F型CAST采用“剪切-粘贴”机制，V-K型CAST为复制型，常伴随供体质粒骨架的共整合；两类系统在真核细胞中均无天然活性，工程化改造主要通过融合核定位序列（NLS）与定向进化实现，如evoCAST系统；共表达大肠杆菌分子伴侣ClpX（AAA+ ATP酶）可显著提升两类CAST的整合效率，但对已进化的evoCAST提升效果有限。V-K型CAST因缺乏TnsA亚基导致的共整合问题，可通过将大核酸酶I-AniI融合到TnsB的N端，并在转座子末端两侧引入I-AniI识别序列解决。evoCAST介导的整合存在强方向偏好，转座子右端（RE）优先位于sgRNA靶位点旁。
合成CAST样系统通过将CRISPR介导的DSB与ITR DNA转座子的整合 machinery结合构建：如FiCAT系统中，piggyBac转座酶融合到Cas9的C端，可实现sgRNA引导的piggyBac转座子靶向整合；利用piggyBac突变体（R372A R375A D450N）可提升切除效率并降低脱靶整合。植物中已将mPing/Pong转座子系统与Cas9或Cas12a诱导的DSB结合，实现mPing转座子的靶向整合，单独表达Pong ORF2与Cas9在大豆中的整合效率优于二者融合表达。CRISPR-piggyBac与CRISPR-mPing/Pong介导的靶向整合不依赖整合位点的典型TDS序列（piggyBac为TTAA，mPing为TTA），且整合后不产生TDS，因此插入序列无法被同种转座酶切除。
5 转座子在高通量真菌代谢工程中的应用展望
非酿酒酵母与丝状真菌的代谢工程面临两大核心挑战：HR效率低下限制靶向基因组编辑，基因功能注释不完善。转座子工具可提供多元化解决方案，包括HR非依赖的靶向整合、全基因组饱和诱变与加速菌株进化适应。
5.1 真菌宿主中的转座子选择策略
合成CAST系统在大片段转基因靶向整合中具有巨大潜力，可便捷引入异源代谢途径与基因调控回路。FiCAT类Cas9/Cas12a-piggyBac融合系统为单组分靶向整合工具，操作简便；evoCAST则具备插入方向更可控的优势。piggyBac的末端序列较短（左35 bp，右63 bp），远低于evoCAST所需的~250 bp，有利于整合cargo在基因组中的稳定性。CAST系统无需改造内源性DNA修复通路即可实现靶向整合，在NHEJ通路活跃的丝状真菌中，敲除Ku70或Ku80等NHEJ核心组件可进一步提升CAST的靶向整合效率。
转座子已广泛用于多物种全基因组诱变，酵母中利用Ac/Ds、Hermes、TcBuster、Sleeping Beauty与piggyBac构建的饱和诱变文库规模可达数十万突变体，远高于丝状真菌的文库规模，这与丝状真菌菌落更大、筛选效率更低有关。不同转座子的整合偏好存在差异，hAT与Tc1/mariner家族中低偏好性的成员可实现更优的全基因组覆盖，适合构建全面的菌株文库。
各类转座子各具优劣：DNA转座子模块更简单、宿主兼容性更广，是诱变的首选；逆转录转座子因复制型机制插入更稳定，且Ty元件整合到启动子上游时可激活基因转录，具备增益功能特性；逆转录转座子的错误倾向逆转录酶已被用于体内连续进化（ICE）系统，可快速筛选获得优化的蛋白变体，拓展了其在酵母蛋白模块优化中的应用潜力。
5.2 转座子诱变文库优良表型与基因型的筛选
宿主代谢刚性常限制异源化合物的生产效率，未知宿主遗传背景因素常成为异源途径的瓶颈，亟需非理性工程策略与大规模筛选以发掘有益基因型。转座子诱变可便捷构建全基因组突变文库，且插入位点可通过常规PCR与Sanger测序鉴定，大规模文库则可通过转座子导向插入位点测序（TraDIS）高效分型，无需全基因组测序即可建立表型-基因型关联。但需注意转座子插入诱变不适用于筛选细微的蛋白点突变，其主要通过基因disruption或表达水平扰动发挥作用。已有研究证实，转座子插入导致的单基因敲除或过表达可显著提升酵母木糖利用效率、高温耐受性及萜类化合物产量，且在Geomyces sp. WNF-15A的红色色素高产菌株筛选中表现出成本效益高、适用于注释不完善宿主的优势。
5.3 高效转座子工具的工程化方向
不同转座子的序列、结构与功能特征差异显著，需针对性优化：piggyBac末端含多个终止密码子，不利于蛋白标签框内融合；Tn5因末端序列短具有应用潜力，但需工程化改造以适应真菌宿主，其单链二聚体高活性变体已在哺乳动物细胞中验证活性，是真菌应用的候选对象；Osmar14/Ost35、impala/mimp1与Tan1/Vader因在真菌中模块化特征明确、转座效率高，是优先选择的对象。
逆转录转座子的宿主范围、核心模块模块化特征等关键参数仍不明确，需通过合成生物学方法系统解析其生物学特性。CAST系统中evoCAST转座效率高、方向特异性强，但需协调表达多个蛋白组分，在真菌中实施难度较高；FiCAT/TATSI类融合系统组分简单，更易在真菌中落地，未来可探索更多CRISPR模块与转座子模块的组合。CAST在真菌中的高效应用仍需优化蛋白与gRNA表达、质粒设计、cargo大小及筛选标记的使用与回收策略。
6 结论
转座子是塑造真核生物基因组结构与表型多样性的重要天然遗传元件。ITR DNA转座子与逆转录转座子的生化机制已被广泛解析，但在酵母与丝状真菌的合成生物学及代谢工程中的应用仍处于起步阶段。CAST系统虽尚未在真菌宿主中得到验证，但有望突破非酿酒酵母HR效率低的限制，实现大片段转基因的高效靶向整合。总体而言，转座子工具可为真菌基因组工程提供多元化解决方案：转座子导向的随机诱变可与二代测序基因型分型无缝衔接，CAST介导的转基因整合无需长同源臂且独立于宿主HR系统，为菌株开发提供了更模块化、精准的技术路径。
