高效液相色谱-二极管阵列检测法验证五种具潜在神经保护活性的Encephalartos物种中amentoflavone型双黄酮

《Scientific Reports》：High-performance liquid chromatography – diode array detection method validation for amentoflavone-type biflavonoids in five Encephalartos species with potential neuroprotective activity

　　

银杏(Ginkgo biloba)是公认的增强记忆的食品补充剂，富含双黄酮(Biflavonoids)。双黄酮在苏铁目(Cycadales)植物中占主导地位。在苏铁类植物中，研究人员选取五种Encephalartos物种，即E. ferox、E. kisambo、E. laurentianus、E. natalensis和E. villosus，通过评估抗氧化和乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制活性来分析其神经保护潜力。E. natalensis和E. ferox强烈抑制AChE(IC50=1.349±0.041和1.948±0.06 μg/mL)，而E. kisambo和E. ferox是具有最强效抗氧化活性的物种。据此，研究人员选择E. ferox进行进一步研究。乙酸乙酯部位的色谱分离得到amentoflavone(1)、bilobetin(2)、ginkgetin(3)、naringenin(6)和apigenin(7)。分离得到的双黄酮(1–3)显示出强效的AChE抑制活性，IC50分别为2.146±0.086、0.762±0.039和1.474±0.061 μg/mL，优于阳性对照利斯的明(rivastigmine)(IC50=3.357±0.103 μg/mL)。研究人员开发了一种经验证的高效液相色谱-二极管阵列检测(HPLC-DAD)方法，用于同时测定五种Encephalartos物种和银杏(Ginkgo biloba)中的五种双黄酮：amentoflavone、bilobetin、ginkgetin、isoginkgetin和sciadopitysin。此外，研究人员还估算了所选植物的总酚含量(TPC)和总黄酮含量(TFC)。本研究强调Encephalartos作为生物活性化合物的潜在来源，可用于进一步的神经活性药物发现研究。

该研究发表于《Scientific Reports》。阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一种以记忆逐渐丧失、定向障碍及几乎全部智力功能受损为特征的退行性疾病，65岁后患病风险每五年翻一倍，目前尚无减缓认知衰退和痴呆发作的明确疗法。AD发病机制涉及胆碱能假说，乙酰胆碱酯酶(AChE)负责分解乙酰胆碱，抑制AChE可维持乙酰胆碱水平从而发挥神经保护作用。天然植物化学成分如双黄酮(Biflavonoids，黄酮类二聚体)具有AChE抑制及神经保护潜力。双黄酮主要分布于裸子植物中，可作为化学分类学标记，但除银杏(Ginkgo biloba)外，许多裸子植物尤其是苏铁科Zamiaceae的Encephalartos属物种的 phytochemistry 与生物活性尚缺乏研究。鉴于银杏叶富含双黄酮并具有神经保护报道，研究人员选取五种Encephalartos物种（E. ferox、E. natalensis、E. kisambo、E. villosus、E. laurentianus）与银杏对比，旨在分析其化学轮廓、验证HPLC-DAD方法定量双黄酮、评估抗氧化与AChE抑制活性及总酚(TPC)、总黄酮(TFC)含量，探索其作为神经活性药物发现的潜在来源。

研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：样本为采集自埃及栽培种群的五种Encephalartos物种叶片及市售银杏叶，经阴干粉碎后分别用乙酸乙酯浸渍提取、80%甲醇震荡提取及甲醇超声提取制备不同分析用提取液；通过硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶色谱进行化合物分离纯化，结合¹H-NMR、DEPTQ、HMBC等核磁共振(NMR)技术鉴定结构；采用反相高效液相色谱-二极管阵列检测(RP-HPLC-DAD)法，依据ICH指南验证专属性、线性、精密度、准确度、检测限(LOD)、定量限(LOQ)及系统适用性；生物活性评价采用DPPH法与磷钼酸盐法测抗氧化活性，Folin–Ciocalteu法测TPC，AlCl₃比色法测TFC，商用试剂盒测AChE抑制活性；数据统计采用单因素方差分析(ANOVA)评估显著性。

研究结果如下：

Identification of the isolated compounds：研究人员对E. ferox叶片乙酸乙酯提取物进行色谱分离，结合¹H-NMR、DEPTQ、HMBC实验及文献比对，鉴定出五个化合物，分别为amentoflavone(1)、bilobetin(2)、ginkgetin(3)、naringenin(6)与apigenin(7)，其中首次报道了naringenin在acetone-d₆溶剂中的¹H-NMR数据，并通过HMBC相关确证ginkgetin结构。

High-performance liquid chromatography – diode array detection (HPLC-DAD) analysis：研究人员建立并验证了同步分析五种amentoflavone型双黄酮（amentoflavone、bilobetin、ginkgetin、isoginkgetin、sciadopitysin）的RP-HPLC-DAD方法，采用RP-C₁₈柱梯度洗脱，检测波长330 nm，保留时间22.4–32.9 min。方法验证显示专属性良好（相邻峰分离度Rs>1.5），线性范围分别为2.5–50 μg/mL（1、2、3）与2.5–60 μg/mL（4、5），相关系数R²为0.9988–0.9998，日内RSD 2.28%–4.17%、日间RSD 1.90%–4.98%，回收率97.06%–103.88%，LOD与LOQ低，系统适用性参数符合USP参考值。定量分析表明E. kisambo中amentoflavone(215.3 μg/g DW)最高，E. ferox中bilobetin(314.7 μg/g DW)与ginkgetin(226.1 μg/g DW)丰富，E. villosus中sciadopitysin(745.8 μg/g DW)高，E. ferox未检出sciadopitysin，银杏叶中各双黄酮含量均较高但部分Encephalartos物种特定成分高于银杏。

Statistical analysis of the results obtained from different plant samples：单因素方差分析(ANOVA)显示各样本间存在高度显著差异（F > Fcrit，P < 0.05），如E. ferox的F=6918.042，p=2.71×10^?24，证实结果可靠且具有判别力。

Biological study：Acetylcholinesterase (AChE) inhibition：AChE抑制实验中，银杏(IC₅₀=0.665±0.02 μg/mL)、E. natalensis(1.349±0.041 μg/mL)与E. ferox(1.948±0.06 μg/mL)抑制活性强于阳性对照rivastigmine(3.357±0.103 μg/mL)；E. laurentianus(3.834±0.117 μg/mL)相当，E. kisambo(7.647±0.234 μg/mL)次之，E. villosus(16.419±0.502 μg/mL)中等。分离化合物中bilobetin活性最强(IC₅₀=0.762±0.039 μg/mL)，其次为ginkgetin(1.474±0.061 μg/mL)与amentoflavone(2.146±0.086 μg/mL)，均优于rivastigmine。

Antioxidant activity：DPPH法显示E. kisambo抗氧化最强(360.32±1.48 mg AEAC/g)，依次为E. laurentianus(353.26±0.61)、E. ferox(345.45±0.79)、银杏(121.66±2.01)、E. natalensis(108.93±1.44)、E. villosus(101.61±1.18)；磷钼酸盐法同样E. kisambo最高(903.25±0.846 AEAC/g DW)，抗氧化能力与TPC、TFC呈正相关。

Total phenolic and total flavonoid contents：TPC测定E. kisambo(593.70±2.41 mg GAE/g DW)、E. ferox(386.11±1.91)、E. laurentianus(298.36±2.12)高于银杏(166.57±1.93)；TFC测定E. kisambo(82.64±0.32 mg QE/g DW)、E. ferox(61.37±0.32)高于银杏(58.48±2.25)。

讨论部分总结：研究人员指出E. ferox、E. natalensis具显著AChE抑制，E. kisambo、E. ferox、E. laurentianus抗氧化及酚类黄酮含量高，双黄酮较单体黄酮神经保护更强，可调节β-淀粉样蛋白(Aβ)聚集并直接保护神经元；分离的双黄酮尤其bilobetin的AChE抑制优于rivastigmine，提示其为关键活性贡献者；多数研究双黄酮为多数Encephalartos物种首次报道，部分物种特定成分高于银杏，具作为膳食补充剂或神经药物先导化合物的潜力。

研究结论部分原文翻译：本研究首次建立了验证五种Encephalartos物种中五种双黄酮同步分析的HPLC方法。大多数所研究的双黄酮在大多数所研究的Encephalartos物种中为首次报道。在五种Encephalartos物种中，E. kisambo叶片的amentoflavone和isoginkgetin含量高于银杏叶。E. natalensis和E. ferox显示出显著的AChE抑制效应。抗氧化活性降序为E. kisambo > E. ferox > E. laurentianus > Ginkgo biloba > E. natalensis > E. villosus，这与TPC和TFC一致。由于在AChE抑制和抗氧化活性方面比银杏更有效，许多研究的Encephalartos物种可能成为用于管理阿尔茨海默病和其他神经元相关疾病膳食补充剂中有前景的植物药。在分离的双黄酮中，bilobetin表现出最强的AChE抑制活性，超过参比药物rivastigmine，并突显了其对该研究物种AChE抑制特性潜在贡献。本研究强调Encephalartos作为生物活性化合物的潜在来源，用于进一步的神经活性药物发现研究。

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