长期乳腺癌幸存者中意义未明的克隆性造血景观

《The Breast》：THE LANDSCAPE OF CLONAL HEMATOPOIESIS OF INDETERMINATE POTENTIAL IN LONG-TERM BREAST CANCER SURVIVORS

　　

背景
意义未明的克隆性造血（CHIP）可干扰基于血液的基因组学分析，并可能受细胞毒性治疗的影响；明确其在乳腺癌化疗后的持续存在情况对于长期生存随访具有重要意义。

患者与方法
研究人员对189名I–III期乳腺癌幸存者进行白细胞层全外显子测序（WES），血液采集时间中位数为诊断后136.5个月。CHIP评估采用预先指定的100个造血驱动基因集合及全外显子组范围检测。临床关联性通过单变量检验和多变量逻辑回归模型评估，变量包括化疗、放疗、年龄、吸烟及肥胖。

结果
在100基因集合中，54/189（28.6%）患者携带≥1个变异，主要为错义突变，以DNMT3A和TET2为主，多击病例罕见。多变量模型中，化疗与panel定义的CHIP无关（OR 0.77；95% CI 0.40-1.48；p=0.432）。类似地，年龄、辅助放疗、肥胖及吸烟状态与panel定义的CHIP无显著关联。基因水平比较显示化疗暴露组间无差异。全外显子组范围内，67/189（35.4%）患者携带≥1个变异；化疗与全外显子组变异阳性无关（OR 0.89；95% CI 0.48-1.67；p=0.721），且化疗暴露组与未暴露组之间无位点差异。

结论
在长期乳腺癌幸存者中进行的白细胞层WES分析显示，既往化疗与CHIP增加之间无队列水平关联。

**论文解读：长期乳腺癌幸存者中意义未明的克隆性造血景观**

**研究背景**
年龄相关的克隆性造血（CH）以携带白血病相关体细胞突变的造血干细胞/祖细胞克隆扩增为特征，在无明确血液系统恶性肿瘤的个体中称为意义未明的克隆性造血（CHIP）。CHIP患病率随年龄增长而升高，涉及一组反复出现的驱动基因，包括DNMT3A、TET2、ASXL1、PPM1D、TP53、SRSF2和JAK2。在癌症幸存者中，细胞毒性治疗暴露与独特的克隆选择模式相关，特别是影响DNA损伤反应（DDR）和凋亡通路的突变（如PPM1D、TP53）富集，并与不良临床结局相关。既往研究显示，化疗和/或放疗塑造了CHIP的适应性景观并改变治疗相关髓系肿瘤的风险，而CHIP的存在、动态及基因特异性效应随治疗类型和累积剂量变化。

在早期乳腺癌（BC）中，辅助系统治疗已通过多基因表达检测逐步个体化，使许多患者安全省略化疗。然而，含蒽环类和烷化剂的方案仍是生物学或临床高风险疾病的标准治疗，带来长期毒性问题，包括某些方案和剂量后AML/MDS的微小但可测量的增加。因此，CHIP在乳腺癌中的临床意义是活跃的研究领域。近期前瞻性和回顾性研究开始定义CHIP在诊断时的患病率、治疗后的演变及其对心血管和肿瘤结局的预后关联，包括接受化疗的老年女性和年轻乳腺癌患者。此外，与既往基因毒性暴露相关的特定CHIP驱动基因可能作为治疗选择压力的分子足迹和晚期效应的潜在生物标志物。

本研究利用长期临床随访，旨在识别和表征乳腺癌幸存者中化疗相关的CHIP，评估其与临床变量的关联，描绘治疗印迹的突变谱，量化克隆大小和谱系，并检验多变量关联，从而为风险适应的生存监测和CHIP知情的外周血基因组学解读提供信息。

**主要关键技术方法**
研究人员开展了一项回顾性队列研究，纳入来自西班牙三所大学医院（University Hospitals Regional, Virgen de la Victoria, Costa del Sol）的189名I–III期浸润性乳腺癌女性幸存者，中位诊断后11.4年采集外周血。主要技术方法包括：1）白细胞层全外显子测序（WES），使用Agilent SureSelect Human All Exon V6捕获panel，在DNBSEQ平台进行PE150测序，平均目标覆盖深度约100×；2）体细胞变异检测采用Mutect2（GATK）进行肿瘤-only模式分析，过滤后保留编码/剪接变异，深度≥30，替代读数≥3，变异等位基因频率（VAF）≥2%，人群等位基因频率（gnomAD AF）<1%，并排除VAF≥30%的疑似胚系变异；3）CHIP定义采用预先指定的100个造血驱动基因panel，并辅以全外显子组范围内由COSMIC造血/淋巴组织证据支持的候选变异；4）多变量逻辑回归模型评估化疗、放疗、年龄、吸烟和肥胖与CHIP的关联；5）COSMIC单碱基置换（SBS）突变特征分析。

**研究结果**

**1. 基于100基因panel CHIP集合的患病率与谱系**
在100基因panel中，54/189（28.6%）患者携带≥1个变异，以错义突变为主，截断事件（无义、移码插入/缺失）较少，多击病例罕见。最常见突变基因为DNMT3A（39%）、TET2（9%）和SETBP1（6%）。多变量逻辑回归分析显示，化疗与panel定义的变异阳性无关联（OR 0.77；95% CI 0.40-1.48；p=0.432），年龄>60岁、辅助放疗、肥胖和吸烟状态均无显著关联。基因水平比较显示化疗暴露组间无差异基因。年龄分层分析也未发现年龄与变异阳性显著相关。

**2. CHIP突变的全外显子组分析**
研究人员补充了100基因panel分析，纳入全外显子组范围内由COSMIC造血/淋巴组织证据支持的候选变异。采用此扩展方法后，67/189（35.4%）患者携带≥1个变异，仍以DNMT3A（31%）、TET2（7%）和SETBP1（4%）为主。多变量逻辑回归显示化疗无关联（OR 0.89；95% CI 0.48-1.67；p=0.721），其余协变量亦无显著关联。基因水平比较无差异。年龄分层分析同样无显著差异。针对辅助放疗的敏感性分析显示，在放疗暴露患者中化疗仍无关联，DDR/p53相关变异罕见且未显著富集于放疗暴露组。COSMIC SBS突变特征分析未发现化疗暴露组与未暴露组之间有任何可评估特征显著富集。

**3. 高VAF克隆限制性分析**
考虑到诊断至采血中位间隔约11年，化疗驱动的CHIP克隆若长期持续应已充分扩增而呈现较高VAF。研究人员以VAF≥10%定义高负担克隆进行分析。在100基因panel中，化疗暴露组有3/28（10.7%）携带高VAF变异，未暴露组为7/26（26.9%），但多变量模型显示化疗与高VAF CHIP无显著关联。全外显子组克隆限制性模型结果类似，化疗再次呈现微弱正向关联但未达统计学显著性，年龄及其他协变量无关联，吸烟状态显示提示性但非显著趋势。

**讨论与结论**
研究人员在长期乳腺癌幸存者中对白细胞层DNA进行全外显子组体细胞变异分析，以表征超越预定驱动基因panel的克隆性造血。两个一致观察结果：第一，保留的变异景观以经典造血驱动因子为主，特别是DNMT3A和TET2，与人群克隆性造血研究和乳腺癌CHIP队列一致，但本队列为诊断后中位超过11年的长期幸存者，低频基因差异可解释为队列结构、采样时间、测序策略、VAF阈值和/或变异过滤的差异。第二，多变量模型中，包括既往化疗、辅助放疗、年龄、吸烟和肥胖，无一变量独立预测保留变异阳性。这些数据与治疗选择模型一致，即DDR克隆在细胞毒性暴露后可能扩增，但队列水平可检测性取决于方案、剂量、潜伏期和基线VAF。

年龄是CHIP的主要决定因素，但本队列中年龄集中于60-70岁，受限的年龄结构可能解释了年龄与变异阳性无显著关联。缺乏年龄匹配的非癌症对照队列限制了将观察患病率与一般人群比较的能力。辅助放疗作为协变量纳入后，化疗仍无关联，DDR/p53相关变异罕见，虽全部发生于放疗暴露患者，但未达统计学显著性。化疗方案组成可能影响治疗相关CHIP，本队列中化疗相对同质，主要为蒽环类为基础，约半数患者接受紫杉类，未记录含铂方案，因此未进行药物特异性关联分析。

本研究是首个在乳腺癌幸存者中利用白细胞层全外显子测序并在治疗后长期幸存者中以外显子组视角检测CHIP突变的研究。中位约11年的诊断-采样间隔捕获了晚期治疗后平衡状态，而非早期暴露后动态，从而减弱了治疗选择的急性信号，但增强了关于长期生存中持久CHIP景观的推断。这一长潜伏期也可能解释DDR相关CHIP突变极低频率，因为治疗选择的DDR突变克隆可能在化疗期间或之后立即扩增，但一旦细胞毒性暴露的选择压力移除后可能收缩。

**研究结论**
在基于panel和全外显子组分析中，既往化疗与长期乳腺癌幸存者中的CHIP无关联。高VAF敏感性分析进一步表明，在治疗十年后，任何治疗选择的CHIP克隆要么未能均匀扩增，要么仍局限于少数易感个体。