整合结构互作组学揭示巨型病毒中蛋白质的组织和结构

《Nature Communications》：Integrative structural interactomics reveals protein organization and structure in a giant virus

　　

巨型病毒是大型DNA病毒，感染单细胞和多细胞真核生物，并形成异常大的细胞外颗粒。（宏）基因组学及（宏）转录组学揭示了其多样化的编码库，但许多蛋白质因缺乏与已知蛋白质的同源性仍有待表征。在此，研究人员整合了交叉连接质谱（XL-MS）、定量蛋白质组学、计算工具和冷冻电镜（cryo-EM）数据，以表征完整墨尔本病毒（melbournevirus）颗粒的蛋白质结构。基于此，研究人员将88个病毒蛋白分配到不同的病毒粒子亚区室，并提出了25个内膜蛋白的拓扑结构。研究人员在冷冻电镜数据中分配了8个衣壳组分，包括将衣壳壳层连接到膜上的蛋白质，反映了病毒粒子成熟的关键点。这些数据提供了宝贵的资源，并展示了整合方法对缺乏表征的生物系统进行系统级结构洞察的能力。

**论文解读：整合结构互作组学揭示巨型病毒蛋白质组织与结构**

**研究背景与问题**

巨型病毒属于核质大DNA病毒（NCLDV），感染单细胞和多细胞真核生物，形成直径达200 nm至2 μm的细胞外颗粒，基因组可达2.8 Mbp。尽管（宏）基因组学和（宏）转录组学揭示了其丰富的编码潜能，但约40%的病毒蛋白缺乏已知结构同源物，尤其对于新兴病毒，AlphaFold等预测方法的准确性受限于序列数据。墨尔本病毒（melbournevirus）作为Marseilleviridae家族成员，具有360 kbp的基因组和403个开放阅读框（ORF），但其病毒粒子结构仅通过冷冻电镜（cryo-EM）部分解析，仅有4个蛋白（主要衣壳蛋白MEL_305和三个组蛋白样蛋白MEL_368、MEL_369、MEL_149）被结构表征。许多ORF编码的蛋白与数据库无同源性，限制了对病毒蛋白身份、结构、功能、相互作用及空间组织的理解。因此，亟需一种系统级方法以解析巨型病毒中蛋白质的结构与空间互作网络。

**研究内容与结论**

研究人员整合交叉连接质谱（XL-MS）、定量蛋白质组学、计算工具和AlphaFold3结构预测，对完整墨尔本病毒颗粒进行结构互作组学分析，成功将88个病毒蛋白分配至两个亚病毒区室（核心与衣壳），提出25个跨膜蛋白的拓扑结构，并利用冷冻电镜数据分配了8个衣壳组分，包括连接衣壳壳层与内膜的次要衣壳蛋白。该研究为理解巨型病毒的蛋白质组织提供了系统级结构见解，展示了整合方法在表征复杂生物系统中的应用价值。论文发表在《Nature Communications》。

**主要关键技术与方法**

1. **交叉连接质谱（XL-MS）**：使用可裂解交联剂DSSO对完整病毒颗粒进行交联，结合蔗糖密度梯度超速离心纯化，通过LC-MS/MS鉴定交联肽段，构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。
2. **AlphaFold3结构预测**：对病毒蛋白进行单体及多聚体结构预测，并通过XL-MS距离约束（Cα-Cα ≤ 35 ?）验证模型质量，利用pTM/ipTM评分筛选高置信度模型。
3. **跨膜蛋白预测**：使用DeepTMHMM、DeepTMpred和TMbed三种算法综合预测跨膜结构域，并结合XL-MS交互伙伴定位确定拓扑方向。
4. **冷冻电镜（cryo-EM）密度拟合**：将AlphaFold3预测模型与墨尔本病毒衣壳顶点3.4 ?分辨率cryo-EM图谱（Burton-Smith等⁵⁰）进行刚性对接及精修，结合蛋白质拷贝数定量（iBAQ）和同源多聚体预测辅助分配。
5. **样本来源**：病毒颗粒从感染Acanthamoeba castellanii（菌株Neff，ATCC 30010）细胞培养上清中纯化获得。

**研究结果**

**1. 墨尔本病毒互作组将包装蛋白聚类至亚病毒区室**
通过XL-MS在三个生物学重复中鉴定出486个可重复的PPI（对应8,908个交联对），涉及108个蛋白。无监督社区聚类将网络划分为两个主要社区：内部核心（与基因组相关）和外部衣壳（膜外）。基于已知定位的四个蛋白（MEL_368、MEL_369、MEL_149为核心；MEL_305为衣壳），通过交互伙伴空间信息将病毒蛋白组分类为33个核心蛋白和55个衣壳蛋白。

**2. 跨膜预测与交联数据分配病毒跨膜蛋白的拓扑结构**
通过三种算法预测出43个推定跨膜蛋白，其中25个出现在互作网络中。利用1291个交联对，为25个蛋白的29个结构域分配了拓扑取向，其中98.5%的交联数据与预测拓扑一致。大多数跨膜蛋白的非跨膜结构域主要位于衣壳侧（外膜叶），提示病毒跨膜蛋白进化出大的衣壳朝向结构域和小的核心朝向区域。

**3. 交联验证墨尔本病毒蛋白的结构预测**
AlphaFold3预测了58个含链内交联的蛋白结构，其中pTM评分≥0.5的模型（45个高置信度结构）与交联距离约束（35 ?）一致。异源二聚体预测中，16个高置信度二聚体模型（置信度评分>0.5，至少50%的链间交联满足距离约束）被鉴定，例如MEL_183:MEL_249复合物。对于组蛋白样蛋白，MEL_368:MEL_149异源四聚体模型比异源二聚体更符合交联数据（5/6满足），且比MEL_368:MEL_369经典核小体复合物更小、更少无序环，表明MEL_368:MEL_149可能形成一种替代性次要核小体种类。

**4. 高置信度蛋白模型定位未表征病毒蛋白的推定功能**
通过Foldseek对45个高置信度单体模型进行结构同源性搜索，25个模型与PDB或AlphaFold数据库中的已知蛋白折叠显著相似（概率评分>0.95）。衣壳区蛋白主要类似蛋白修饰酶（如氨基酸氧化酶MEL_085、糖基转移酶MEL_146/MEL_398），核心区蛋白类似核酸相关蛋白（如TATA-box结合蛋白MEL_275、RNase III样蛋白MEL_219）。特别地，MEL_206模型与Chlamydia trachomatis去泛素化酶DUB1结构相似，且与amoebal泛素的复合物预测显示催化半胱氨酸（C304）位于活性位点。进一步发现MEL_206的交互伙伴MEL_368和MEL_369存在二甘氨酸修饰（泛素化标志），提示MEL_206可能具有去泛素化酶功能。

**5. 通过整合建模优化冷冻电镜衣壳结构**
将AlphaFold3模型拟合至3.4 ? cryo-EM图谱，首先验证了MCP（MEL_305）的准确性。通过筛选与MCP或MEL_213b交联的衣壳区候选蛋白，成功分配了MEL_213b（同源二聚体，PCɑ组分）、MEL_234、MEL_276、MEL_341、MEL_097、MEL_297和MEL_331作为次要衣壳蛋白。MEL_276和MEL_331被预测为跨膜蛋白，提示其结构角色为衣壳-膜锚定。蛋白拷贝数定量（iBAQ）和同源多聚体预测（如MEL_256为五聚体）进一步支持了分配。最终，整合方法分配了7个次要衣壳蛋白及五邻体蛋白MEL_256，展示了XL-MS、结构预测和蛋白质组学结合揭示衣壳细节的能力。

**总结与讨论**

讨论部分指出，整合XL-MS与AlphaFold3建模的方法成功解析了墨尔本病毒颗粒的空间和结构互作组，为巨型病毒蛋白质组组织提供了前所未有的见解。XL-MS数据将蛋白质组分为由内膜分隔的两个空间独立社区（核心与衣壳），并识别出25个跨膜蛋白及其拓扑结构，其中两个跨膜蛋白（MEL_331、MEL_276）被证实为次要衣壳蛋白，可能通过物理接触桥接衣壳与膜，类似现象在PBCV-1和medusavirus中也有观察到，提示保守的结构策略。基于高置信度结构模型的功能预测（如衣壳区糖基转移酶、核心区去泛素化酶MEL_206）为后续体外验证提供了指导。此外，MEL_149:MEL_368异源四聚体作为替代核小体样结构的预测得到交联数据支持，可能发挥调控基因转录的作用。最后，通过整合建模成功分配了8个衣壳组分，包括五邻体蛋白，并利用蛋白质拷贝数定量和同源多聚体预测增强了分配可信度。未匹配的剩余密度可能源于蛋白质柔性或AlphaFold预测限制，但PPI网络和拷贝数分析暗示了MEL_052、MEL_066等作为衣壳相关蛋白的候选性。

**研究结论翻译**

总之，研究人员提出了一种整合工作流程，结合XL-MS、蛋白质组学、cryo-EM和计算建模，以系统级视角洞察墨尔本病毒颗粒的空间和结构互作组。重要的是，该方法仅需天然病毒粒子，无需遗传操作，且不受病毒大小或复杂性限制。因此，它可以轻松地推广到其他Marseilleviridae、NCLDV成员，甚至微米级巨型病毒，无需对流程和管线进行重大修改。同样，巨型病毒家族之外的其他新兴病原体也是这一强大平台的吸引目标，能够实现对未被充分研究的生物系统进行快速高通量表征。