需要3′末端磷酸基团在RNA底物上的核酶连接酶

《Nature Communications》：A ribozyme ligase that requires a 3′ terminal phosphate on its RNA substrate

　　

核酶（ribozyme）可能在基于RNA的原始生命中催化代谢过程和促进基因组复制中发挥了重要作用。体外进化（in vitro evolution）使研究人员能够扩展RNA的生物化学能力，特别是新的核酶化学。在此，研究人员报告了核酶连接酶（ribozyme ligase）的偶然发现，这些核酶催化RNA底物的2′-羟基基团攻击其自身的5′-三磷酸基团，但仅当底物在其亲核的2′-羟基基团邻位具有一个3′-磷酸基团时才发生。这些连接酶对底物3′-磷酸基团的需求类似于基于蛋白质的RNA修复途径中的酶学机制。研究人员提出，核酶催化的3′-磷酸化RNA的连接可能为原始细胞中的RNA修复提供了途径。研究人员证明，这些核酶特异性地连接到存在于细胞RNA异质混合物中的3′-磷酸化RNA。研究人员进一步表明，这些核酶可以捕获具有3′-磷酸和2′?3′-环磷酸（2′?3′-cyclic phosphate）末端的切割RNA，从而使研究人员能够选择性扩增所捕获的RNA。这些结果证明了它们作为富集试剂在转录组学研究中对RNA切割产物进行谱分析的潜在实用性。研究人员的发现不仅报告了RNA中一种新的催化反应性，还提供了对核酶进化、原始RNA修复以及在RNA测序中的潜在应用的见解。

**研究背景与问题**
在基于RNA的原始生命假说中，核酶（ribozyme）被认为催化了关键代谢反应并推动了基因组复制。然而，天然核酶的反应类型有限，通过体外进化（in vitro evolution）虽已扩展了RNA的催化能力，但仍有大量未知的化学反应有待发掘。当前研究旨在从部分随机化的RNA文库中筛选出能够催化5′-三磷酸（5′-triphosphate）底物与核酶3′-羟基（3′-OH）之间标准3′?5′磷酸二酯键连接的连接酶（ligase），却意外获得了具有全新催化活性的核酶群体。该发现不仅揭示了RNA催化多样性的新维度，还为理解原始RNA修复机制及开发RNA测序富集工具提供了重要线索。论文发表在《Nature Communications》。

**主要技术方法**
研究人员采用体外进化策略，基于一个先前表征的“磷酸咪唑连接酶”（AIP-Ligase）构建了部分随机化的RNA文库（复杂度约10¹⁴序列），通过链霉亲和素磁珠捕获与5′-三磷酸、3′-生物素标记的RNA底物发生连接的序列，经RT-PCR和体外转录进行多轮富集。利用高通量测序分析各轮输出序列，并选取丰度最高的五个簇（CS1-CS5）进行后续表征。采用SHAPE探测（选择性2′-羟基酰化引物延伸）结合RNAstructure软件预测二级结构。通过位点特异性突变、底物化学修饰（如5′-磷酸、5′-羟基、3′-磷酸、3′-硫代磷酸等）及金属离子置换实验，解析连接反应的化学机制。底物捕获实验使用大肠杆菌（E. coli）tRNA混合物作为异质性背景，验证核酶对3′-磷酸化RNA的特异性富集能力。

**研究结果**

**1. New ligase ribozymes isolated from in vitro evolution**
从第6轮选出的五个主要簇（CS1-CS5）中，CS1、CS2、CS4、CS5表现出对底物3′-生物素化状态的依赖，而CS3才是先前报道的真正的三磷酸连接酶。CS1-CS5与亲本AIP-Ligase相比存在10–28个突变，其中CS1、CS2、CS4、CS5在3小时内催化连接产物达到20%–50%，速率（k_obs）为0.4–1.5 h^?1，而CS3活性低约75倍。

**2. Unexpected reaction between the substrate 2′-hydroxyl and the ribozyme 5′-triphosphate groups**
CS1催化连接不依赖外部模板（仅3倍活性下降），且5′端删除25个核苷酸后完全失活，而3′端删除14个核苷酸仍保留活性。底物5′端化学修饰（5′-PPP、5′-P、5′-OH）不影响连接，但核酶5′端必须为三磷酸；底物末端腺嘌呤替换为脱氧核糖核苷酸后连接消失，表明亲核基团是底物2′-羟基（2′-OH）。通过Terminator 5′→3′核酸外切酶和RNase R 3′→5′核酸外切酶消化实验，证实连接产物中存在非经典2′?5′磷酸二酯键。

**3. Ligation requires a 3′-phosphate group on the substrate**
CS1、CS2、CS4、CS5无法连接具有2′,3′-顺式二醇末端的底物，但游离生物素不能挽救活性；将生物素移至底物5′端或替换为脱硫生物素均不影响活性，而直接连接3′-磷酸无TEG-生物素的底物（Substrate-3′P）具有与生物素化底物相当的连接速率。底物2′-磷酸、3′-羟基构型（Substrate16rA-2′P）无活性，表明必须为2′-OH邻位有3′-磷酸。动力学分析显示，CS1催化底物3′-磷酸化连接的本底速率提高超过5个数量级。硫代磷酸取代实验（Substrate-3′sP）中，添加Cd²⁺可部分恢复活性，提示Mg²⁺可能通过内球配位与3′-磷酸作用。

**4. Comparative structural analysis of the isolated ligase ribozymes**
CS1、CS2、CS4、CS5序列间存在11–22个突变，但SHAPE探测与序列比对发现它们可能共享保守茎环结构（如5′-CCACUCA-3′与3′-GGUGAGU-5′配对区域）。TurboFold预测CS1、CS2、CS4具有共同二级结构，而CS5结构不同。SHAPE数据中部分区域的高反应性提示某些茎区可能未形成稳定配对，但整体上这些核酶存在结构相似性。

**5. Specific capture and amplification of 3′-phosphorylated RNA**
CS1对3′-磷酸化底物具有高亲和力（K_M = 0.1649 ± 0.042 μM，k_cat/K_M = 7670 M^?1 s^?1）。在60倍过量tRNA混合物中，CS1仍能特异性捕获FAM标记的3′-磷酸化RNA，且荧光信号与底物浓度线性相关（0.05–0.4 μM）。CS1对2′,3′-环磷酸（cP）末端RNA无活性，但经酸水解转化为3′-磷酸后即可被捕获。捕获产物可通过RT-PCR有效扩增，即使不经磷酸酶处理，逆转录酶也能跨越2′?5′连接和3′-磷酸位点。底物特异性测试表明，核酶对末端为腺嘌呤（A）的底物活性最高，而对末端为C或U无活性，G活性极低；核酶5′端必须为鸟嘌呤（G），G→A突变完全失活。

**总结讨论与结论**
讨论部分指出，该研究偶然分离出四种主要类型的核酶连接酶，催化底物2′-OH对核酶5′-PPP的进攻，严格依赖底物3′-磷酸。这一反应性与蛋白质基RNA修复酶（如tRNA连接酶、RtcB连接酶）类似，但机制不同：tRNA连接酶使用5′-腺苷酰焦磷酸（App）和2′-磷酸化的底物，而RtcB直接利用3′-磷酸参与反应。该核酶活性可能为原始细胞中RNA断裂后的修复提供了一条“拯救途径”：5′切割产物（含2′,3′-cP）酸水解为3′-磷酸，3′切割产物（含5′-OH）可被预生物条件下三磷酸化，随后由核酶连接恢复完整RNA链，虽引入2′?5′键，但不影响复制且可由其他途径修复。该模型补充了非酶促的3′?5′焦磷酸连接修复途径。研究还表明，单一选择压力可导致多种催化功能的富集，凸显了RNA作为催化分子的多功能性。
**研究结论**：研究人员的发现不仅报告了RNA中一种新的催化反应性，即核酶连接酶催化底物2′-OH与核酶5′-PPP之间的连接，且严格需要底物3′-磷酸，还提供了对核酶进化、原始RNA修复以及在RNA测序中潜在应用的见解。这些核酶可用作特异性富集3′-磷酸化RNA切割产物的试剂，有助于转录组学中RNA切割和修复途径的全面分析，并可能鉴定疾病生物标志物。