中性粒细胞髓过氧化物酶作为RSV严重程度的功能性生物标志物：对体外治疗筛选的启示

《Nature Communications》：Neutrophil myeloperoxidase as a functional biomarker for RSV severity: implications for in vitro therapeutic screening

　　

呼吸道合胞病毒（RSV）是婴儿严重下呼吸道感染的主要原因，但治疗方法缺乏。本研究旨在开发一种临床前模型，能够重现婴儿RSV毛细支气管炎的关键临床结果，例如中性粒细胞活化和迁移到气道。与年龄匹配的对照组相比，入住儿科重症监护病房的严重RSV疾病婴儿的外周血中性粒细胞显示出升高的髓过氧化物酶（MPO）。为了机械性地模拟这种反应，研究人员建立了一个气-液界面（ALI）系统，整合了儿科气道上皮细胞、内皮细胞和来自成人的中性粒细胞，以重现血-气道屏障。在RSV感染后，使用或不使用抗病毒药物瑞德西韦或RSV604治疗，通过流式细胞术评估中性粒细胞迁移和活化。虽然两种药物都降低了病毒载量，但只有RSV604减弱了MPO表达。该模型表明MPO可用作治疗效果的读数。靶向中性粒细胞驱动的炎症通路可能对于减少婴儿RSV感染的病理学至关重要。

呼吸道合胞病毒（RSV）感染是5岁以下儿童严重下呼吸道感染和住院的主要原因，每年约导致320万住院和11.8万死亡。然而，针对免疫功能正常人群的有效抗病毒疗法仍十分有限，现有方案主要集中于预防和对症支持。中性粒细胞作为先天免疫的核心细胞，在RSV感染早期被大量招募至肺部，在清除病毒的同时，过度浸润和脱颗粒却可加剧气道炎症和上皮损伤，成为疾病严重程度的关键驱动因素。目前，缺乏能够准确重现婴儿RSV毛细支气管炎中中性粒细胞行为（尤其是跨上皮迁移和活化表型）的临床前模型，这制约了抗炎和抗病毒联合疗法的筛选与优化。因此，研究人员开展了本研究，旨在建立一个整合血管内皮细胞与儿科气道上皮细胞的生理相关体外模型，以模拟中性粒细胞在RSV感染过程中的跨屏障迁移和活化，并将这些体外反应与婴儿临床表型相关联，最终评估现有抗病毒药物对中性粒细胞介导的炎症的调节作用。该研究发表在《Nature Communications》。

研究人员主要采用了以下关键技术与方法：从英国Great Ormond Street Hospital儿科重症监护病房（PICU）招募RSV感染婴儿（n=5）及未感染对照婴儿（n=5），同时收集健康成人外周血（n=15）作为体外模型的中性粒细胞来源。建立气-液界面（ALI）培养系统：将儿科或成人原代气道上皮细胞（AECs）分化28天，部分实验在膜基底侧加入人脐静脉内皮细胞（HUVEC）共培养，以模拟血-气道屏障。以MOI=1感染重组GFP标记的RSV A2株，24小时后进行中性粒细胞跨上皮迁移实验（1小时）。通过流式细胞术检测中性粒细胞表面和胞内标志物（CD11b、CD64、CD62L、髓过氧化物酶（MPO）、中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）），并利用Oxford Nanopore测序进行转录组分析。抗病毒药物瑞德西韦（RDV，6.6 μM）或RSV604（10 μM）在感染后4小时加入基底侧。

研究结果如下：

**Comparable peripheral blood neutrophil phenotypes across age, with higher neutrophil degranulation markers in RSV-infected infants**
通过流式细胞术比较年龄相关的表型差异，发现婴儿中性粒细胞前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）低于成人，提示细胞更小、颗粒度更低。基线时，仅CD64在婴儿中显著高于成人。与婴儿对照相比，RSV感染婴儿外周血中性粒细胞的MPO和NE表达显著升高（p<0.05），而CD11b、CD64和CD62L无显著变化。

**RSV infection drives neutrophil phenotypic and transcriptional reprogramming in infants**
RSV感染婴儿的外周血中性粒细胞绝对计数显著低于对照（平均9.9×10⁵ vs 2.6×10⁶ cells/mL，p<0.05），提示组织招募增强。流式细胞术和比值比（Odds ratio）分析确认MPO和NE是RSV感染中富集最显著的标志物。转录组主成分分析（PCA）显示RSV感染与对照样本明显分离，差异表达基因富集于抗病毒、干扰素刺激、细胞因子应答和炎症通路。

**RSV infection increases neutrophil migration and activation in a paediatric airway epithelium model**
将成人中性粒细胞加入ALI系统后，RSV感染显著增加中性粒细胞跨上皮迁移，且穿过儿科上皮的迁移数量高于成人上皮。流式分析表明，与RSV感染的儿科上皮共培养的中性粒细胞在基底侧（模拟血液循环）和粘附层（上皮界面）中MPO表达显著高于成人上皮组，而NE、CD11b、CD64和CD62L差异不显著。

**Endothelial cells modulate cytokine response and neutrophil migration without affecting RSV replication**
加入内皮细胞（EC）层后，细胞屏障功能增强（荧光葡聚糖通透性降低），不改变RSV复制水平。但EC+AEC共培养的基础细胞因子（IL-6、IL-8、IP-10）分泌高于单独AEC培养，RSV感染后进一步升高。

**Endothelial cells heighten degranulation marker expression and the cytokine response following trans-epithelial migration during RSV infection**
在EC存在下，RSV感染后基底侧中性粒细胞的MPO和NE表达显著更高，完全迁移至顶侧的中性粒细胞数量也增加。迁移后基底侧上清中IL-6、IL-8浓度升高，MPO酶活性也显著高于模拟对照组。

**Higher basolateral MPO and NE in response to RSV infection is dependent on direct contact with RSV-infected AECs**
使用允许（3.0 μm孔径）或阻止（0.4 μm孔径）中性粒细胞迁移的膜插入物，结果发现仅在允许迁移条件下，RSV感染后基底侧中性粒细胞的MPO和NE才显著升高，表明这种激活依赖于与RSV感染上皮的直接接触而非仅靠可溶性因子。

**Antiviral treatments reduce viral load but not inflammatory cytokine production**
RDV和RSV604均显著降低病毒载量（p<0.05），但两者预处理均导致IL-6和IP-10分泌相对于药物处理的未感染对照增加。

**The antiviral RSV604 reduces neutrophil-mediated inflammation during RSV infection**
RSV604处理显著增加迁移至顶侧的活中性粒细胞数量，并降低几乎所有脱颗粒标志物（尤其是MPO和NE）在基底侧和迁移中性粒细胞上的表达，其在雷达图中的表型更接近模拟对照。RDV则未见类似调节效果。MPO酶活性在RSV604组呈降低趋势。

**讨论与结论**
该研究将髓过氧化物酶（MPO）确定为中性粒细胞活化的关键标志物，并作为RSV感染疾病严重程度的潜在系统性指标。利用临床相关体外模型，研究人员证明中性粒细胞活化主要由与RSV感染上皮细胞的直接接触驱动，导致CD11b、MPO和NE表达增加，这些特征与严重疾病相关。MPO成为最显著调节的标志物，通过表达和酶活性测定得到确认。尽管瑞德西韦和RSV604都降低了MPO水平，但均未使其恢复到基线水平，表明脱颗粒仅被部分抑制。值得注意的是，只有RSV604有效降低了MPO表达，表明其减轻中性粒细胞介导的组织损伤的潜力。此外，基底外侧中性粒细胞中高MPO表达提示其在全身性炎症中的可能作用。这些结果表明，中性粒细胞MPO表达应被视为评估和筛选RSV抗病毒疗法的相关生物标志物。