提取策略与C18固相分馏塑造选定药用植物的酚类特征、抗氧化能力及癌细胞抗增殖活性

《Antioxidants》：Extraction Strategy and C18 Solid-Phase Fractionation Shape Phenolic Profiles, Antioxidant Capacity, and Cancer Cell Antiproliferative Activity of Selected Medicinal Plants

　　

药用植物是生物活性化合物的丰富来源，包括酚酸、黄酮类化合物、鞣花鞣质（ellagitannins）和其他次生代谢产物。然而，特定酚类化合物组对抗增殖活性的贡献仍未充分阐明。本研究通过评估具有不同酚类特征的C18固相萃取（SPE）组分是否与不同的抗增殖反应相关联，扩展了研究人员之前的粗提物筛选。同时，比较了提取策略以评估方法依赖性的酚类回收率和抗氧化能力变化，并对柳兰（Chamaenerion angustifolium L. Holub）进行了额外的单一物种植被阶段分析，以评估收获阶段的影响。使用分光光度法和高效液相色谱（HPLC）分析进行植物化学表征。在测试的提取方法中，75%（v/v）甲醇水溶液是最有效的常规溶剂，超声辅助提取获得了最高的总酚含量（TPC）、总黄酮含量（TFC）和自由基清除活性（RSA）值。柳兰（C. angustifolium L. Holub）的植被阶段分析显示，酚类含量和抗氧化活性存在显著差异，在开花初期观察到最高水平。针对五种癌细胞系（4T1、A549、Caki-1、HCT116和MCF7）评估了抗增殖活性，同时使用HEK-293细胞作为永生化非癌细胞参考模型进行一般细胞毒性评估。线性混合模型分析证实，在所有测试的癌细胞系中均存在显著的孵育时间效应，IC₅₀值通常在延长暴露后降低。统计上显著的F2-F3差异是植物依赖性的。柳兰（C. angustifolium L.）中富含月见草素B（oenothein B）的30%（v/v）甲醇水溶液组分（F2）显示出更强的抗增殖活性，而夏栎（Quercus robur L.）、黑核桃（Juglans nigra L.）、核桃（Juglans regia L.）和加拿大一枝黄花（Solidago canadensis L.）的60%（v/v）甲醇水溶液组分（F3）显示出更强的活性。这些发现表明，抗增殖活性与所选富含酚类的SPE组分的定性和定量组成相关，而非单一通用组分效应。在应用条件下，所有测试组分对HEK-293细胞均表现出较低的细胞毒性；然而，选择性声明应使用额外的正常细胞或原代细胞模型进行确认。总体而言，这些发现阐明了提取策略、收获阶段和靶向分馏在将酚类组成与生物活性联系起来中的作用。

**论文解读：提取策略与C18固相分馏揭示药用植物酚类特征与抗增殖活性的植物依赖性关联**

**研究背景与目的**

药用植物富含酚类化合物，包括酚酸、黄酮类化合物和鞣花鞣质（ellagitannins），这些化合物具有抗氧化和抗癌活性。然而，在复杂的植物基质中，特定酚类化合物组对癌细胞抗增殖活性的贡献仍不明确。先前的研究（Bimbirait?-Survilien? et al.）筛选了多种药用植物的粗提物，发现富含鞣花酸衍生物的提取物对多种癌细胞系具有显著抗增殖活性，但无法区分该活性是由酚酸/鞣花鞣质富集组分、黄酮类化合物富集组分还是未分级粗提物整体所驱动。为填补这一空白，本研究旨在通过C18固相萃取（SPE）分馏，将先前有活性的粗提物分离为极性不同的酚类富集组分，并评估其抗增殖活性，同时比较提取策略和植被阶段对酚类组成的影响，从而揭示酚类组成与生物活性之间的植物依赖性关系。该论文发表在《Antioxidants》。

**主要技术方法**

研究人员从立陶宛维陶塔斯·马格努斯大学考纳斯植物园采集了五种药用植物：柳兰（Chamaenerion angustifolium L. Holub，地上部分，分五个植被阶段采集）、夏栎（Quercus robur L.，叶片）、黑核桃（Juglans nigra L.，果皮）、核桃（Juglans regia L.，果皮）和加拿大一枝黄花（Solidago canadensis L.，地上部分）。采用以下关键技术：1）分光光度法测定总酚含量（TPC，Folin–Ciocalteu法）、总黄酮含量（TFC，AlCl₃比色法）和自由基清除活性（RSA，DPPH法），以芦丁当量（RE）表示；2）高效液相色谱-紫外可见检测（HPLC-UV-Vis）和高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ED）进行酚类化合物鉴定和半定量分析；3）C18固相萃取（SPE）分馏，将粗提物（75% v/v甲醇水）依次用0%、30%、60%、100% v/v甲醇水洗脱，仅保留F2（30%甲醇）和F3（60%甲醇）用于后续分析；4）MTS比色法评估抗增殖活性，针对五种癌细胞系（4T1、A549、Caki-1、HCT116、MCF7）和HEK-293永生化非癌细胞参考模型，在24、48、72小时孵育后测定IC₅₀值；5）线性混合模型、配对t检验、McNemar精确检验、Spearman相关性分析等统计方法。

**研究结果**

**3.1 柳兰的植被阶段依赖性变化**
通过分光光度法和HPLC分析，研究人员发现柳兰的TPC、TFC、RSA及主要酚类化合物（月见草素B（oenothein B）、3,4-二羟基苯甲酸、鞣花酸）含量在开花初期达到最高，显著高于其他阶段（p<0.001）；在盛花期降至最低，开花末期略有回升。这表明酚类积累受植被阶段动态调控，早期生殖阶段最有利于次生代谢物积累。

**3.2 提取方法对植物化学特征的影响**
在柳兰、夏栎和黑核桃的代表性样品中，比较了不同极性溶剂提取、超声辅助提取（UAE）、水解辅助提取和发酵辅助提取。结果显示，75% v/v甲醇水是最有效的常规溶剂；UAE进一步提高了TPC、TFC和RSA（分别增加7.4–15.1%、7.4–8.6%、9.6–18.4%），是最佳方法。水解辅助提取（尤其是酸水解）显著降低了TPC、TFC和RSA，表明降解占主导。发酵辅助提取（Lacticaseibacillus rhamnosus GG，48小时）使TPC和RSA小幅增加（5.0–5.6%），但TFC降低（14.8–15.0%），提示发酵可促进部分酚类释放但可能降解黄酮类化合物。

**3.3 C18 SPE组分的化学特征及其抗增殖活性**
**3.3.1 酚类特征与抗氧化能力**
C18 SPE分馏后，F2（30%甲醇）和F3（60%甲醇）组分富含酚类化合物，具有可比的TPC、RSA和总峰面积（p>0.05），但F3的TFC显著更高（p=0.045）。HPLC分析确认F2富集水解鞣质和简单酚酸（如柳兰中的月见草素B），F3富集黄酮类化合物和肉桂酸衍生物（如鞣花酸）。溶剂交换（5% DMSO水）后，相对分布未改变。

**3.3.2 抗增殖活性**
针对五种癌细胞系，线性混合模型显示孵育时间对IC₅₀有显著影响（p<0.001），IC₅₀值随孵育时间延长而降低。植物物种×组分交互作用显著（p<0.001），表明F2和F3的相对活性因植物而异：柳兰中F2（富含月见草素B）的IC₅₀显著低于F3，抗增殖活性更强；夏栎、黑核桃和加拿大一枝黄花中F3的IC₅₀显著低于F2；核桃中F3在15个测试条件中有12个达到50%抑制，而F2仅3个，McNemar检验确认F3更活跃（p=0.004）。最强效效应见于柳兰F2对4T1细胞（IC₅₀=0.12 mg DRM/mL）和黑核桃F3对HCT116细胞（IC₅₀=0.29 mg DRM/mL）。所有组分对HEK-293细胞毒性较低（活力>90%）。Spearman相关性分析显示，未经多重比较校正时，TPC/RSA与IC₅₀呈负相关趋势，但校正后均不显著，提示活性由具体组分而非总酚含量驱动。

**讨论与结论**

讨论部分强调，提取策略和植被阶段显著影响酚类回收和抗氧化能力，但抗增殖活性主要取决于植物依赖性、组分特异性的酚类组成，而非单一通用组分或总酚含量。研究人员指出，C18 SPE分馏可有效区分活性贡献，柳兰中月见草素B富集的F2更活跃，而其他物种中黄酮类化合物富集的F3更强。局限性包括：以芦丁为单一标准品、仅鉴定标准品确认的峰、HEK-293细胞不能完全代表正常组织、发酵条件未优化等。结论部分指出：本研究显示提取策略和C18 SPE分馏塑造了选定药用植物提取物的酚类特征、抗氧化能力和抗增殖活性，而柳兰的单一物种植被阶段分析证明了收获时间对该物种酚类和抗氧化积累的重要性。主要贡献不是确认粗提物具有生物活性（这在之前已显示），而是证明将先前有活性的75%（v/v）甲醇水提取物分馏成富含酚类的C18 SPE组分揭示了植物依赖性的生物活性模式。特别是，所选组分的活性不能归因于单一的通用组分或仅总酚含量；相反，它取决于每个植物来源组分的定性和定量组成以及所测试的癌细胞模型。提取方法比较和植被阶段分析应解释为支持性工作流程，它们表明酚类回收和抗氧化能力受提取条件和收获阶段的强烈影响，为解释植物依赖性活性提供了化学背景，但独立于直接预测生物活性。总体而言，结果支持使用靶向分馏作为缩小酚类组成与抗增殖活性之间关系的有用方法，同时表明在不同植物科、植物部位和物候阶段之间进行外推时应谨慎。